论文部分内容阅读
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，它催化超氧阴离子自由基(superoxide radical，O2-)的歧化反应。O2-被认为对各种生物大分子及其它细胞组分具有严重的损伤作用，SOD能预防和治疗由超氧阴离子自由基引起的多种疾病如家族性肌萎缩性侧索硬化(FALS)等。在临床上，已用于一些炎症、肿瘤、皮肤病、心血管病等疾病的治疗，用于延缓衰老。在国外，已有含SOD化妆品制剂、抗辐射SOD胶囊、治疗局部缺血症SOD制剂等的专利生产。美国、日本及西欧一些国家早已开发重组人SOD药物，有的已经进入Ⅱ期和Ⅲ期临床研究。因而SOD是一种很有前途的药用酶，作为保健食品及化妆品的有效成分亦有广泛的应用前景，但SOD在体内的稳定性比较差、半衰期比较短，从而使其功能的发挥受到一定的限制。
本研究分别构建人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)和突变hCuZn-SOD表达载体并在大肠杆菌中表达，测定两种hCuZn-SOD在不同温度及pH条件下的酶活力。结果表明，两种重组蛋白主要以包涵体形式存在，表达量都占菌体总蛋白的45％以上，突变hCuZn-SOD酶活力高于hCuZn-SOD，且突变hCuZn-SOD稳定性高于hCuZn-SOD，提示从基因突变的角度改善酶的性能的尝试是有益的。然后根据文献提供的序列，设计引物，用PCR技术扩增得到藻蓝蛋白cpc启动子，经过测序，多步克隆，与目的基因hCuZn-SOD、rbcS polyA终止区和Km基因连接，构建为pCMSOD质粒。然后用EcoRI和SAII对蓝藻Synechoccus sp.PCC7942的总染色体进行双酶切，所得的随机片段与经过同样双酶切的表达重组质粒pcMSOD大片段(含cpc启动子、hCuZn-SOD基因、rbcS polyA终止区和Kmr基因)连接，构建成为含有蓝藻染色体DNA同源片段的供体表达质粒。利用自然转化法将该供体质粒转化宿主Synechoccus sp.PCC7942，通过卡那霉素筛选得到具有卡那霉素抗性的转基因藻株。该藻株在BG-11培养基中生长良好，提示随机整合靶位合适。以hCuZn-SOD基因片段两侧序列设计引物对转化藻株的基因组DNA进行PCR扩增并测序，证明目的片段已经整合到宿主的基因组中。转化藻通过光强12001x诱导后，进行SDS-PAGE，通过凝胶电泳分析发现与预期外源目的基因表达产物hCuZn-SOD大小相当的16KD左右的特异蛋白条带，蛋白扫描结果显示目的蛋白占可溶性蛋白的6.8％，通过Western-blot进一步证实了此特异蛋白的存在。动物实验结果显示转hCuZn-SOD突变基因聚球藻可明显提高小鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力和全血过氧化氢酶(CAT)活性，显著提高小鼠血清和肝脏中CuZn-SOD和总SOD(T-SOD)的活力，显著降低小鼠血清和肝脏的丙二醛(MDA)含量，提示转hCuZn-SOD突变基因聚球藻有较强的抗氧化作用。
本研究首先分别构建hCuZn-SOD和突变hCuZn-SOD表达载体并在大肠杆菌中表达，比较两种表达蛋白的酶活力和稳定性，然后通过随机整合方式将突变的hCuZn-SOD基因整合到蓝藻Synechoccus sp.PCC7942染色体上，动物实验证明转突变hCuZn-SOD基因蓝藻口服后具有较强的抗氧化作用，本研究结果具有一定理论意义和应用价值，为进一步研究开发半衰期长的可直接口服的hCuZn-SOD奠定了基础。