本研究以欧亚养殖良种大菱鲆(Scophthalmus maximus)为实验材料,运用组织切片、原位杂交、cDNA末端快速扩增(RACE)、实时荧光定量PCR和原核表达等技术手段,比较了雌性大菱鲆和小鼠垂体组织形态结构、细胞类型和促性腺激素(FSHβ和LHβ)在垂体中分布;筛选出在大菱鲆卵巢发育过程中下丘脑、垂体、卵巢和肝脏中的最佳内参基因;获取了大菱鲆促性腺激素共同糖蛋白α亚基(CGα)和LHβ的全长cDNA序列,分析其生物信息学特性,查明了其组织表达和下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴关键基因(fshβ、lshβ、cgα、Gn RH、kiss及kissr)在仔鱼早期发育过程中表达规律;通过大肠杆菌原核表达成功制备了大菱鲆FSHβ和LHβ重组蛋白。本研究结果丰富了大菱鲆生殖内分泌调控机制研究内容,同时为大菱鲆苗种标准化生产提供了有效技术支撑。相关结果如下:1.大菱鲆和小鼠垂体结构及激素分泌细胞解剖学比较对性成熟雌性大菱鲆和小鼠垂体进行组织学和组织化学分析,结果表明:大菱鲆垂体呈典型的鸡心形,背脑室,位于间脑腹侧表面,通过垂体柄与下丘脑紧密相连。相比之下,小鼠垂体呈椭圆形,中心为灰白色,两侧为灰红色,位于颅底蝶鞍垂体窝。在大菱鲆和小鼠中发现了两个明显的区域,即腺垂体(AH)和神经垂体(NH)。大菱鲆腺垂体包括前腺垂体(RPD)、中腺垂体(PPD)和后腺垂体(PI)。而NH不明显,呈手指状突起进入PPD。然而,小鼠AH只包括远侧部PD和PI。NH呈半圆形分布。小鼠PD区主要分布三种类型的细胞(嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嗜嫌色细胞),而大菱鲆的PPD、RPD和PI区都有分布。此外,小鼠的嗜酸性细胞的百分比高于大菱鲆,而嗜碱性细胞的百分比低于大菱鲆。在小鼠垂体中,上述三种细胞的直径明显高于大菱鲆。大菱鲆卵巢发育分为5个时期:卵黄生成前期、卵黄生成早期、卵黄生成晚期、核迁移期和闭锁期。fshβ和lhβ免疫反应信号在主要位于大菱鲆AH周围和中心区域的垂体细胞。然而,小鼠fshβ和lhβ免疫反应细胞在同一细胞中表达,并存在于PD中。大菱鲆和小鼠垂体形态、细胞系和促性腺激素(fshβ和lhβ)表达均存在显著差异。2.大菱鲆卵巢发育过程中内参基因的筛选以18S核糖体RNA(18s)、β-肌动蛋白(actb)、延伸因子1-α(ef1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、组织蛋白酶D(ctsd)和β-2-微球蛋白(b2m)6个内参基因的稳定性进行q RT-PCR分析。利用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件分析了大菱鲆卵巢发育过程中下丘脑-垂体-卵巢-肝脏(HPOL)轴内参基因的稳定性。结果表明,下丘脑、垂体、肝脏和卵巢中最稳定的内参基因分别是ef1α、actb、ctsd和actb。在正常情况下,下丘脑中最适合的内参基因组合是18s、ef1α和ctsd;垂体中的actb、ctsd和18s;卵巢中的actb和ctsd;肝脏中的gapdh和ctsd。此外,在大菱鲆卵巢发育过程中,雌激素受体α(erα)的表达谱与上述最适合内参基因的无显著差异。然而,在卵巢发育过程中,没有一个或一对内参基因适合作为内部控制,也不能解释四种组织之间的扩增差异。综上,相关结果为筛选大菱鲆卵巢发育过程中最适内参基因,进行q RT-PCR分析提供了技术支撑。3.大菱鲆促性腺激素亚基CGα和LHβ的cDNA克隆及HPG轴关键基因在早期发育过程中的表达分析采用同源克隆的方法,从雌性大菱鲆(Scophthalmus maximus)垂体中分离得到编码共同糖蛋白α亚基(CGα)和促黄体生成素β(LHβ)的全长序列。结果表明,CGα和LHβ的cDNA分别由669和660个核苷酸组成,分别编码129和139个氨基酸。CGα和LHβ表现出典型的糖蛋白激素特征,与硬骨鱼类有高度同源性,并且与大西洋庸鲽的同源性最近。CGα、FSHβ和LHβ在垂体中表达丰富,在垂体外组织中表达较少。cgα、fshβ和lhβ在大菱鲆孵化后1天可检测到,在早期变态(22d)同时达到高峰。cgα和fshβm RNA在变态前显著升高,在变态早期达到高峰,然后逐渐下降,直至变态完成。相反,lhβm RNA在变态前逐渐下降,在变态早期达到高峰,然后在变态期下降。此外,大菱鲆早期发育过程中cgα的m RNA水平显著高于fshβ和lhβ,而fshβ和lhβ的m RNA水平无显著差异。而大菱鲆促性腺激素的相关调控基因c Gn RHⅡ、s Gn RH、sb Gn RH、Kiss1、Kiss2和Kissr均在大菱鲆孵化后5d内迅速上升且达到最大值,5d后开始下降至14d,14d至30d之间表达量较低且为上下波动的趋势。4.大菱鲆促性腺激素FSHβ和LHβ基因原核表达本研究设计了FSHβ和LHβ的特异性引物,使用垂体的cDNA模板进行PCR扩增,将扩增得到的片段连接到p Cold I载体上并挑选阳性克隆进行测序,从而构建出重组表达质粒p Cold I-FSHβ和p Cold I-LHβ。将重组质粒转入BL21感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示FSHβ重组蛋白大小约为20.1KDa。LHβ的表达结果与其类似,其重组蛋白大小约为23.0 KDa。这为制备FSHβ和LHβ特异性抗体奠定了基础。