牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）无细胞壁,属于柔膜体纲,是当前引起牛呼吸道疾病的重要病原之一,导致多种临床病症,主要包括支气管肺炎、中耳炎、乳腺炎、生殖道炎、腱鞘炎、关节炎、脑膜炎、角结膜炎、流产与不孕等。由于其毒力因子不清、致病机理不详,到目前为止,仍然缺乏有效的针对牛支原体感染的疫苗,抗生素治疗效果差、疗程长且病原菌对抗生素耐药性不断增加,致使本病目前仍然缺乏有效的防控手段,因此,给肉牛和乳制品行业带来巨大的经济损失。本实验以前期研究获得的M.bovis HB0801 P1强毒株和其体外连续传代毒力致弱的P150株为研究对象。通过同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）技术和串联质谱法,对牛支原体强弱毒力菌株进行差异蛋白质组学分析,筛选出潜在的毒力相关因子并进行功能鉴定。取得如下结果:1.通过iTRAQ定量蛋白质组学分析,在强弱毒力菌株中共获得592个定量蛋白质信息,蛋白质数量占预测的基因组ORF的77.7%（592/762）。相对于强毒菌,在弱毒菌中共有37种差异表达蛋白,其中25种下调表达,12种上调表达的蛋白质。2.为了探索差异表达蛋白质和毒力之间的关系,综合考虑蛋白质的表达量差异和进行密码子突变的可操作性,本研究共选取16种在弱毒菌株中下调表达的蛋白质,包括Mbov＿135、158、282、283、299、312、338、364、418、461、468、469、654、656、720、721和2种表达量无差异的蛋白质Mbov＿086和Mbov＿699为研究对象。采用重叠延伸PCR将UGA突变成UGG后,成功克隆了17个基因（Mbov＿135克隆失败）,并转化大肠杆菌表达系统,最终获得15个纯化的重组蛋白（Mbov＿086、158、282、283、299、312、338、364、461、468、469、656、699、720、721）,2个重组菌（Mbov＿418和Mbov＿654）未表达外源蛋白。然后,制备抗纯化的重组蛋白rMbov＿469的单克隆抗体和抗纯化的重组蛋白rMbov＿086、338和rMbov＿699的兔多克隆抗体,用于后续实验。3.通过荧光定量qRT-PCR和Western Blot方法,对差异表达蛋白进行mRNA表达水平和蛋白表达水平的验证,得到与iTRAQ一致结果。通过差异表达蛋白质的分子特征并结合文献报道,分析差异表达蛋白的生物学功能,结果表明在弱毒菌株中下调表达的蛋白质部分与毒力相关,包括NADH氧化酶,乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADH）,亚甲基四氢叶酸-tRNA-（尿嘧啶-5-）-甲基转移酶,脂蛋白,ABC转运蛋白,黏附相关蛋白等;而在弱毒菌株中上调表达的蛋白质可能是一些与胁迫相关的蛋白质。4.对6种纯化的蛋白质（Mbov＿282,Mbov＿299,Mbov＿338,Mbov＿461,Mbov＿469和Mbov＿721）进行Western Blot分析,结果表明它们能被牛支原体阳性血清识别,被鉴定为新型免疫原性蛋白。5.为了进一步探索差异蛋白质和毒力之间的关系,选取弱毒菌株中下调表达的蛋白Mbov＿338蛋白（乙醇脱氢酶,ADH）进行毒力相关性研究,结果显示,纯化的重组ADH（rADH）具有乙醇脱氢酶活性。Western Blot结合间接免疫荧光检测显示ADH分布在牛支原体的胞质和胞膜中;同时ADH是牛支原体的一种免疫原性蛋白,在牛支原体各不同分离株中具有保守性。间接免疫荧光结合激光共聚焦检测表明:纯化重组ADH（rADH）能够黏附于胚胎牛肺上皮细胞。黏附抑制实验表明抗rADH抗体可显著抑制牛支原体与胚胎牛肺细胞的黏附。此外,通过斑点印迹和酶联免疫吸附实验发现rADH与纤连蛋白以剂量依赖性方式结合。这些结果表明ADH通过与宿主纤连蛋白相互作用而在牛支原体感染中发挥细胞黏附因子的作用。本研究通过iTRAQ定量蛋白质组学方法,获得牛支原体强弱毒力菌株差异蛋白质表达谱,并对其中一种在弱毒力菌株中下调表达蛋白质——ADH的研究发现,它是一个黏附相关蛋白,暗示其可能是牛支原体潜在的一种毒力因子。本研究为进一步探索牛支原体发病机制奠定分子基础;同时,ADH作为一种新型免疫原性蛋白质可能成为未来疫苗候选抗原或诊断标志物。