小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的以发热、口炎、腹泻、肺炎为主要特征的一种急性传染病,PPRV基因组为有囊膜的多形性单股无节段负链RNA,编码6种结构蛋白(N、M、 P、L、F和H蛋白),其中N蛋白是PRRV核衣壳蛋白,也是主要结构蛋白,是PPRV抗原性最稳定、含量最高的蛋白,动物感染PPRV后可迅速产生针对N蛋白的高滴度抗体,虽然该抗体不具有中和病毒的活性,但抗体维持时间较长。水泡性口炎(Vesicular Stomatitis, VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)引起多种动物感染易感的以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水泡样病变为主要特征的一种急性、高度接触性传染病,VSV基因组为线状单股负链RNA,从3”到5’端依次编码了N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白,其中其中N蛋白能保护病毒免受核糖核酸酶的降解,在病毒的复制及转录过程中起着很关键的作用,且N蛋白具有高度保守性,VSV所有型之间均具有交叉保护性。鉴于此,本研究对PPRV和VSV N蛋白进行了原核表达,并对表达的蛋白进行了应用,即利用纯化后的PPRV N蛋白建立了PPRV间接ELISA抗体检测方法；利用纯化后的VSV N蛋白制备了VSV单克隆抗体。旨在为PPRV的临床诊断、流行病学调查、疫苗免疫效果监测等提供一种简单、快速、敏感、特异的血清学诊断方法；为VSV发病机理研究和VSV抗原诊断试剂的研制奠定基础。参照GenBank中已发表的PPRV基因组N基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约1500 bp的N基因片段,将目的片段亚克隆至pCold I原核表达载体中,经IPTG诱导重组N蛋白的表达,重组蛋白经亲和层析法纯化后,Western-Blotting检测证明具有重组蛋白良好的免疫原性。以重组N蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPRV抗体的间接ELISA诊断方法,该方法检测口蹄疫病毒、羊痘病毒、伪狂犬病毒阳性血清均为阴性；该方法重复性试验的变异系数小于10%;该方法与进口小反刍兽疫血清抗体检测试剂盒的符合率为达98.3%。参照GenBank中已发表的VSV基因组N基因序列,分别合成VSV不同血清型的N基因,经序列对比分析后,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1200 bp的N基因片段,将目的片段亚克隆至pCold I原核表达载体中,经IPTG诱导重组N蛋白的表达,重组蛋白经亲和层析法纯化后,Western-Blotting检测证明具有重组蛋白良好的反应性。以重组N蛋白为免疫原免疫6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选获得了3株稳定分泌VSV特异性抗体的杂交瘤细胞株,间接免疫荧光试验表明3株单克隆抗体均可与VSV发生特异性反应。综上,本研究利用原核表达技术表达的PPRV N蛋白具有良好反应活性,以纯化的重组N蛋白为包被抗原建立的PPRV间接ELISA抗体监测方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和准确性,为PPRV抗体检测、临床诊断、流行病学调查以及疫苗免疫效果监测等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。利用原核表达技术表达的VSV N蛋白具有良好的免疫原性,以纯化的重组N蛋白为免疫原,制备的3株抗VSV单克隆抗体具有良好的免疫原性,为建立以单克隆抗体为基础的免疫学检测试剂盒的研制与应用奠定了基础。