神经生长因子（nerve growth factor,NGF）是最早被发现的神经营养因子。天然的NGF由3个亚基（α、β和γ）组成,其中,仅β亚基具有生物学活性。β-NGF是由118个氨基酸的肽链以非共价键组成的同源二聚体。它不仅是神经细胞生长和修复必需活性物质,在神经系统、免疫系统和内分泌系统的相互作用中有着重要调节功能。而且具有促进伤口愈合、细胞生长和抑制肿瘤细胞生长的作用。尤其对于因胆碱能神经元退变或缺失所引起老年性痴呆症,以及新生儿缺血性脑病,帕金森症的治疗方面有明显的疗效。因此,在神经损伤的基础及临床研究中,神经生长因子有重要的理论意义和实用价值。目前神经生长因子药物已经上市,因不易穿透血脑屏障,故其治疗主要局限于周围神经病变。人类免疫缺陷病病毒表达的反式激活蛋白（trans-activating protein, TAT）分子中,有一段富含碱性氨基酸的多肽片断（TAT48-60）,即蛋白转导结构（protein transduction domain ,PTD）,可以介导蛋白分子从细胞外向细胞内直接跨膜转运,具有广谱的蛋白转导作用。且穿透范围很广,几乎可穿透所有的组织和细胞,甚至可以通过血脑屏障,而且对细胞没有损伤。因此这种细胞穿膜肽在基础医学研究和临床治疗方面被认为是一种有效的穿膜载体,有着广泛的应用前景。基于以上几个方面的原因,我们构建了PTD-NGF融合基因,对其表达产物的生物活性进行了检测分析。主要研究内容和实验结果如下:1. PTD-NGF融合基因原核表达载体的构建提取小鼠脑组织总RNA,逆转录成cDNA。设计小鼠β-NGF基因引物,利用PCR技术从小鼠脑组织cDNA扩增β-NGF基因。通过工具酶将β-NGF基因插入克隆载体pcDNA/FRT载体。再人工合成PTD-NGF融合基因引物,其上游引物为β-NGF基因5′端融合了PTD序列。利用PCR技术从pcDNA/FRT-NGF中扩增PTD-NGF融合基因。通过工具酶将PTD-NGF融合基因插入pBV220表达载体。2.PTD-NGF融合蛋白的表达将pBV220/PTD-NGF表达载体和对照质粒pBV220转化大肠杆菌DH5α,42℃热诱导表达后收集菌体超声破碎。分别对收集的上清和包涵体行SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达。结果发现在相对分子质量约14×103处出现表达蛋白条带,与融合蛋白理论预计位置相符。表达产物主要以包涵体形式存在,约占全菌总蛋白的20%,在包涵体中约占70%。3. PTD-NGF融合蛋白的纯化、复性及鉴定包涵体经过尿素充分洗涤和溶解后,经Sephacryl-200分子筛层析,收集主峰SDS-PAGE可见目的条带。采用稀释法逐步透析尿素,复性融合蛋白。复性产物经聚乙二醇浓缩后,Bradford法测定的蛋白浓度为350μg/ml。取纯化复性后的重组蛋白分别进行SDS-PAGE,用NGF多克隆抗体经Western印迹分析,同时设定NGF标准品对照,结果在14×103附近可见2条目的条带,进一步验证产物为目的蛋白,同时也说明融合蛋白具有NGF蛋白的抗原性。4.PTD-NGF融合蛋白的生物活性检测PC12细胞经加PTD-NGF融合蛋白培养基培养2周后,较正常培养的对照组PC12细胞,出现细胞胞体增大,形态从圆形变得不规则,生长出突起,说明融合蛋白具有促进PC12细胞分化现象,初步表明重组蛋白应具有NGF样生物学功能。用含PTD-NGF融合蛋白培养基培养HepG2细胞后,通过细胞免疫组化检测PTD-NGF是否能够穿透细胞膜进入胞内,同时设立NGF标准蛋白阴性对照组。结果PTD-NGF融合蛋白组阳性显色,NGF标准蛋白阴性对照组未显色。表明用PTD确有协助NGF蛋白穿透细胞膜作用。综上所述,我们成功构建了PTD- NGF融合基因,实现了其在大肠杆菌中的高效表达,经纯化和复性后,获得了纯度较高可溶的PTD-NGF融合蛋白。Western印迹检测表明它与特异性抗体具有良好的反应性,并具有刺激和促进PC12细胞分化的活性。同时,细胞学实验表明该融合蛋白可介导NGF穿过细胞膜进入细胞内,证实了PTD-NGF融合蛋白具有跨膜转导功能。这些研究结果为NGF进一步应用于神经损伤修复及神经系统退行性疾病治疗的研究奠定了基础。