肌内脂肪含量是影响猪肉品质的关键因素,对猪肉多汁性、嫩度、风味等食用品质具有重要的影响,提高肌内脂肪含量是改善猪肉品质的重要途径。然而,肌内脂肪与皮下脂肪的沉积呈现一定正相关性。因此,明确肌内脂肪特有的生理特性和调控方式是实现肌内脂肪特异性调控的前提。糖皮质激素对脂肪沉积具有明显的促进作用,能够诱导前体脂肪细胞的增殖和分化。已有研究表明,糖皮质激素反应性差异是导致组织间脂肪沉积差异的重要原因。本研究首先对猪皮下脂肪与肌内脂肪对糖皮质激素反应性的差异进行探讨。在此基础上,通过肌肉组织培养液以及肌肉与脂肪细胞共培’养等方法,从肌肉对脂肪细胞影响的角度进一步探索肌内与皮下脂肪组织对糖皮质激素反应性存在差异的机制,并寻找影响脂肪细胞糖皮质激素反应性的肌肉因子,以期揭示肌内脂肪独特的调控方式,为特异性提高肌内脂肪含量奠定基础。具体结果如下:’1.皮下与肌内脂肪细胞对糖皮质激素反应性差异研究使用不同浓度的糖皮质激素类似物-地塞米松(DEX)处理皮下、肌内前体脂肪细胞,CCK8法检测细胞活力。结果显示,DEX促进了两种前体脂肪细胞的增殖,在24、48、72小时,100nM的DEX对皮下前体脂肪细胞的促进作用显著高于肌内前体脂肪细胞(P<0.05 )。使用2.5μM的DEX诱导脂肪细胞分化,检测细胞内甘油三醋(TG)水平,发现DEX对皮下前体脂肪细胞中TG积聚的促进作用比肌内脂肪细胞高29%(P<0.05 )。采用DEX处理皮下或肌内成熟脂肪细胞,结果表明两种细胞中TG均无显著增加,而脂肪的分解水平显著增加(P<0.05),但两种细胞间无显著差异。胰岛素(INS)具有与DEX协同作用促进脂肪沉积的功能,DEX与INS联用能够增加成熟脂肪细胞中TG的积聚,并抑制脂肪的分解;对皮下成熟脂肪细胞中TG积聚的促进作用和对脂解的抑制作用均显著高于肌内脂肪细胞(P<0.05)。采用促肾上腺皮质激素ACTH (可促进内源性糖皮质激素的释放)处理14头母猪,研究在体水平皮下脂肪组织(SAT)和肌内脂肪组织(IMAT)对糖皮质激素的反应性。结果显示,ACTH处理显著促进了 SAT和IMAT中脂肪合成标志基因FASN、STAT5、SRC2和SRC3的表达,并且对SAT的促进作用显著高于IMAT (P<0.05 )。ACTH处理显著促进了两种脂肪组织中脂肪分解标志基因ATGL和HSL的表达,并且对SAT的促进作用显著高于IMAT (P<0.05)。结果表明,皮下脂肪对内源性糖皮质激素的反应性强于肌内脂肪。2.皮下与肌内脂肪组织糖皮质激素受体水平差异的研究为探究糖皮质激素反应性差异的机理,检测了糖皮质激素受体(GR)在皮下脂肪组织(SAT)、肌内脂肪组织(IMAT)中的表达模式。结果显示SAT中GR功能亚型GRα的mRNA水平是IMAT的2.2倍(P<0.05 )。为分析SAT和IMAT中GRα水平差异的原因,对GR基因的9种Exon 1变体进行检测,结果显示,变体E1-C的表达丰度最高,占GR总mRNA>比例的65%~76°/%,因此GR总水平受E1-C的影响最大;变体E1-F、E1-D、E1-B、E1-A、E1-H具有中等的表达丰度(1.6%-10.2%); E1-E、E1-J、E1-G 的表达丰度较低(0.4%～2.8%)。SAT中变体E1-A,E1-C和E1-H的水平显著高于IMAT (P<0.05 )。进一步检测9种Exon 1变体在GRα和GRβ亚型中的表达比例,结果显示,变体E1-A,和E1-B在GRβ中的表达比例显著高于GRα (P<0.05),表明E1-A和E1-B更多的影响GRβ的表达;而变体E1-H只在GRα中表达,表明变体E1-H转录本只编码GRα亚型,并且SAT中E1-H的水平是IMAT的1.9倍,差异显著(P<0.05 )。因此,SAT比IMAT具有较高GRα水平的主要原因,是由于其具有较高水平的最主要变体E1-C和GRα特异变体E1-H。3.肌肉组织培养液通过抑制GRα的表达影响脂肪细胞的增殖分化和凋亡基于肌内脂肪所处的特殊位置,假设肌肉能够抑制GRα的水平从而影响肌内脂肪的糖皮质激素反应性。使用肌肉组织培养液(TCF)处理前体脂肪细胞,GR变体E1-C和E1-H表达水平分别降低了 32%和73%, GRα的水平下调了 46%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。细胞计数结果显示,TCF处理抑制了前体脂肪的增殖,与对照组相比细胞数目减少了 41% (P<0.01 ); GR的拮抗剂RU486对脂肪细胞的增殖具有类似的抑制效果,使脂肪细胞数目减少了 38% (P<0.01); DEX处理能够部分挽救TCF对脂肪细胞增殖的抑制作用,TCF+DEX组细胞数目极显著高于TCF组(P<0.01 )。油红O染色及细胞中TG含量测定结果显示TCF显著抑制了前体脂肪细胞的分化,TG的沉积量减少了 45% (P<0.01 )。流式细胞仪检测前体脂肪细胞周期,结果显示TCF将前体脂肪细胞阻滞在了G2-M期,G2-M期的细胞增加了 60%,而G0-G1期的细胞减少了 23%; RU486对细胞周期具有类似的作用,使G2-M期的细胞增加了 38%, G0-G1期细胞减少了 14%;在TCF中加入DEX能够部分挽救TCF对细胞周期的抑制作用(P<0.01 )。流式细胞仪检测皮下前体脂肪细胞的凋亡,结果显示,TCF促进了前体脂肪细胞的凋亡,晚期凋亡率增加3.3倍,细胞坏死率增加8倍;RU486对前体脂肪细胞凋亡具有类似的促进作用,晚期凋亡率增加2.4倍,细胞坏死率增加6.8倍;而DEX能够挽救TCF的作用(P<0.01)。4. C2C12肌管通过抑制GRα影响3T3-L1脂肪细胞的增殖分化和凋亡利用Trans-well小室建立C2C12成肌细胞与3T3-L1前体脂肪细胞共培养模型,研究成熟肌管对脂肪细胞增殖分化以及凋亡的影响。细胞计数及EdU染色结果表明,C2C12成熟肌管显著抑制3T3-L1前体脂肪细胞的增殖,细胞总数减少了 34%,EdU阴性细胞数增加了 89%,与对照组相比差异显著(P<0.01)。油红O染色以及TG含量测定结果表明,C2C12肌管显著抑制了脂肪细胞的分化,细胞中TG沉积量减少了39% (P<0.01 )。同时,C2C12肌管引起3T3-L1前体脂肪细胞中Caspase 3活性显著,增加,早期凋亡的细胞比例从3.8%上升到14.1%,晚期凋亡的细胞比例从6.8%上升到 9.1% (P<0.01)。进一步研究C2C12对3T3-L1脂肪细胞中GRα水平以及糖皮质激素反应性的影响。检测GRα的mRNA和蛋白水平发现,C2C12显著抑制了 3T3-L1细胞中的GRα水平(P<0.01).检测共培养前后3T3-L1脂肪细胞中增殖、分化以及凋亡关健基因对DEX的反应性,结果表明C2C12肌管显著抑制了 3T3-L1细胞中增殖标志基因CyclinD与脂肪分化标志基因PPARy,促进了凋亡标志基因FAS的表达(P<0.01 )。DEX能够部分挽救C2C12对3T3-L1的作用,但是无法将共培养组3T3-L1细胞中的Cyclin D、PPARy和FAS恢复到与对照组同样的水平。表明C2C12肌管降低了 3T3-L1前体脂肪细胞的糖皮质激素反应性,抑制3T3-L1细胞的增殖、分化,促进了其凋亡,验证了肌肉组织培养液的结果。5.肌肉生长抑制素抑制了脂肪细胞中GRα的表达,影响脂肪细胞的增殖和凋亡使用肌肉分泌因子肌肉生长抑制素(MSTN)处理脂肪细胞,GRα和变体E1-C、E1-H的mRNA水平分别降低了 36%、35%和33%, GRα蛋白水平降低了 24%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。CCK8法与EdU染色检测细胞增殖,结果显示MSTN抑制了脂肪细胞的增殖,细胞活力显著降低,EdU阴性细胞的比例增加了 1.83倍(P<0.01 )。流式细胞仪检测结果显示G0-G1期的细胞增加了 8.3%, S期的细胞减少了 5.1%,差异显著(P<0.05);细胞凋亡检测结果显示早期和晚期凋亡率分别增加了220%和90%,差异极显著(P<0.01 )。6.肌肉生长抑制素上调E1-C和E1-H启动子的甲基化水平,抑制GRα的表达GR基因启动子区的DNA甲基化会抑制其表达,此外,有研究报道MSTN能够调控脂肪细胞的DNA甲基化。亚硫酸盐测序结果表明,在检测到的甲基化修饰位点中,变体E1-C的启动子在肌内脂肪组织中的整体甲基化水平为66%,显著高于皮下脂肪中的46% (P<0.05); E1-H启动子的整体甲基化水平为15%,显著高于皮下脂肪中的 9% (P<0.05)。其中,CpG8、CpG14、CpG30、CpG37 和 CpG38 位点在皮下脂肪和肌内脂肪中表现出明显不同的甲基化状态(P<0.05)。通过DNA甲基免疫沉淀(MeDIP)检测了 MSTN对脂肪细胞中E1-C和E1-H启动子甲基化水平的影响,结果表明MSTN处理使E1-C启动子甲基化水平由15%升至29%,差异显著(P<0.05 ),E1-H启动子的甲基化水平由15%升至26%,差异极显著(P<0.01)。综上所述,肌肉通过抑制GR变体E1-C和E1-H的表达,造成肌内脂肪组织中GRα水平下降,降低了其糖皮质激素反应性,阻碍了糖皮质激素诱导的促增殖、促分化和抗凋亡作用,最终抑制了肌内脂肪的沉积。而肌肉因子MSTN是其中发挥作用的因子之一,通过增加肌内脂肪中GR变体E1-C和E1-H启动子的甲基化水平,抑制GRα的表达。