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目的:pten是一个具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因，能维持内环境的稳定和正常的物质代谢，pten低表达或缺失均与肿瘤的发生发展密切相关。自噬的缺陷或激活与肿瘤的发生或进展相关，PTEN在肿瘤细胞自噬中的作用及其调控机制尚未完全明了。拓扑替康（Topotecan,TPT）是新一代半合成的、水溶性的喜树碱类似物，可特异性抑制细胞核内的拓扑异构酶Ⅰ（Topo Ⅰ）活性，属于DNA损伤药物。ATM属于PI3K家族蛋白，是DNA损伤的直接感应因子。在前期研究中，在肿瘤细胞内发现TPT可引起ATM的磷酸化水平升高，且伴随PTEN的核转位，提示ATM与PTEN存在某种关系。因此本文探讨ATM、PTEN介导拓扑替康诱导肿瘤细胞自噬及其分子机制，阐明PTEN在DNA损伤介导肿瘤细胞自噬中的作用。方法：体外培养人肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞，用分子克隆技术建立稳定或瞬时转染质粒的细胞株；用激光共聚焦显微镜术观察PTEN核转位、YFP-LC3的点状聚集及γ-H2AX聚焦点的形成；用Western blot方法检测phospho-ATM、LC3、P62、ATM、phospho-PTENS113、γ-H2AX蛋白及Flag标签的表达；用ATM特异性抑制剂Ku55933和siRNA-ATM瞬时转染抑制ATM的活性；用免疫共沉淀法检测Flag与phospho-PTENS113的结合作用。结果：1拓扑替康诱导A549细胞与HeLa细胞ATM的磷酸化Western blot检测显示，拓扑替康能显著激活了A549细胞与HeLa细胞内ATM的磷酸化水平；随着作用浓度、作用时间的增加，ATM激酶磷酸化水平增强，呈现浓度、时间依赖性。2ATM调控拓扑替康诱导的PTEN核转位激光共聚焦显微镜观察拓扑替康处理A549细胞和HeLa细胞后，内源性PTEN由细胞浆转位到细胞核内，当用ATM特异性抑制剂KU55933抑制ATM激酶活性后，PTEN核转位明显被抑制；接着HeLa细胞转染入3×Flag-PTEN-WT质粒，检测外源性PTEN转位，结果发现，与内源性PTEN转位一致，PTEN由细胞浆转位到细胞核，当用ATM特异性抑制剂KU55933或转染siRNA-ATM抑制了ATM激酶活性后，PTEN核转位显著被抑制；分别提取A549细胞和Hela细胞的细胞浆、细胞核蛋白，Western blot检测显示拓扑替康处理后，细胞浆PTEN蛋白量减少，细胞核PTEN蛋白量增多；当用ATM特异性抑制剂KU55933或siRNA-ATM抑制了ATM激酶活性后，PTEN核转位被抑制。3ATM调控拓扑替康诱导的PTENS113的磷酸化我们用Scansite软件预测ATM可能磷酸化PTEN第113位丝氨酸，为此针对PTEN蛋白的第113位点制备了特异性磷酸化抗体，并通过Western blot验证了此抗体的有效性；前面已证明拓扑替康处理可诱导ATM的磷酸化及PTEN核转位，首先用Western blot检测发现p-PTENS113的表达呈现浓度依赖性，免疫共沉淀的结果显示拓扑替康可以诱导PTENS113的磷酸化，再用Western blot检测显示，当转染siRNA-ATM抑制了ATM激酶活性后，PTEN核转位被抑制，且拓扑替康诱导PTENS113的磷酸化显著被抑制，综合以上提示，ATM调控拓扑替康诱导的PTENS113的磷酸化。4拓扑替康诱导肿瘤细胞A549与HeLa发生自噬及PTEN过表达或敲低对其诱导肿瘤细胞自噬的影响4.1拓扑替康诱导肿瘤细胞A549与HeLa发生自噬A549细胞和HeLa细胞瞬时转染YFP-LC3质粒，加入拓扑替康处理，激光共聚焦显微镜观察，发现两种细胞的胞浆中自噬标志物YFP-LC3蛋白的点状聚集明显增加；Westernblot检测显示，拓扑替康处理A549细胞和HeLa细胞后，存在LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，LC3-Ⅱ表达均增加；P62蛋白的表达则随药物浓度、时间梯度的递增显著减少；LC3-Ⅱ表达和P62蛋白表达均呈现非常明显的浓度、时间梯度依赖关系；4.2PTEN过表表达或敲低对拓扑替康诱导的肿瘤细胞A549和HeLa自噬的影响A549细胞和HeLa细胞转染shRNA-PTEN质粒，构建稳定低表达PTEN的A549细胞株和HeLa细胞株，Western blot检测显示拓扑替康处理后，低表达PTEN的细胞株其自噬被抑制；瞬时转染3×Flag-PTEN-WT质粒入A549细胞和HeLa细胞，Western blot检测显示拓扑替康处理后，过表达PTEN的细胞株其使自噬发生增强。5PTEN蛋白S113位的磷酸化在PTEN核转位和细胞自噬中起关键作用5.1PTEN核转位需要PTEN蛋白S113位的磷酸化首先我们构建了突变型3×Flag-PTEN-S113A质粒，即将PTEN蛋白第113位点由丝氨酸突变为丙氨酸。将3×Flag-PTEN-S113A质粒瞬时转染入HeLa细胞，拓扑替康作用后免疫荧光技术进行处理，激光共聚焦显微镜观察，发现Flag处于细胞浆中，并未转位到细胞核中，即是PTEN没有发生核转位；而转染入3×Flag-PTEN-WT质粒处理组Flag由细胞浆转位到细胞核，即PTEN发生了核转位。Western blot检测显示，TPT处理后，转入野生型质粒的PTENS113的磷酸化水平增加，当S113位点发生突变后，TPT就不能诱导PTEN蛋白发生磷酸化。综合上述提示PTEN核转位是通过ATM调控PTENS113的磷酸化而使其转位的。5.2PTEN蛋白S113位的磷酸化促进细胞自噬发生将3×Flag-PTEN-WT质粒和3×Flag-PTEN-S113A质粒分别瞬时转染入A549细胞和HeLa细胞，拓扑替康进行处理。Western blot检测结果显示，当PTEN蛋白S113位点由丝氨酸突变为丙氨酸后，在A549细胞和HeLa细胞TPT处理组中，TPT诱导的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化均被显著抑制，该结果提示PTEN蛋白S113位的磷酸化促进细胞自噬发生。6拓扑替康诱导肿瘤细胞A549和HeLa发生DNA损伤及PTEN-S113A对拓扑替康诱导肿瘤细胞DNA损伤的增强作用6.1拓扑替康诱导肿瘤细胞发生DNA损伤激光共聚焦显微镜观察拓扑替康处理A549细胞和HeLa细胞后，可在细胞核内看到DNA损伤的标志物γ-H2AX聚焦点，随作用时间的延长，γ-H2AX聚焦点逐渐增多，且含有γ-H2AX聚焦点的细胞数也变多，呈现时间依赖性；Western blot检测显示，随着拓扑替康作用时间的延长，γ-H2AX蛋白表达逐渐增加，与激光共聚焦显微镜观察结果一致，也呈现时间依赖性。6.2PTEN蛋白的第113位点突变增强TPT诱导肿瘤细胞DNA损伤瞬时转染3×Flag-PTEN-WT质粒或3×Flag-PTEN-S113A质粒入A549细胞和HeLa细胞，拓扑替康进行处理，激光共聚焦显微镜观察显示，转染入3×Flag-PTEN-S113A质粒组的细胞核内比其他两组细胞其DNA损伤标志物γ-H2AX聚焦点增多得更明显，且更强；Westernblot检测也显示转染入3×Flag-PTEN-S113A质粒组的细胞比其他两组细胞γ-H2AX蛋白表达增加得更显著。结论：1拓扑替康可诱导A549细胞和HeLa细胞发生ATM磷酸化、细胞自噬和DNA损伤，且呈浓度、时间依赖性。2拓扑替康在A549细胞和HeLa细胞内通过ATM激酶磷酸化PTEN蛋白S113，诱导PTEN核转位，介导细胞自噬、抑制DNA损伤。3在A549细胞和HeLa细胞内，沉默PTEN拓扑替康诱导的自噬被抑制，过表达PTEN则促进自噬发生。