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隐孢子虫是重要的人兽共患原虫之一,也是导致儿童腹泻的第二大病原。目前,未见针对隐孢子虫病有效的药物及疫苗,唯一被FDA批准的硝唑尼特对隐孢子虫的效果也是有限的。miRNAs是一类内源性非编码小RNA分子,其通过调控基因的表达,进而影响机体许多生物学过程,如细胞的增殖、分化、凋亡以及生物体的发育等。研究表明,miRNAs可以调节超过60%的哺乳动物蛋白编码mRNAs,在调控隐孢子虫感染和宿主防御中发挥重要作用。TLRs(Toll-like receptor,TLRs)是一种常见的病原模式识别受体,其在病原体入侵细胞期间起着非常重要的作用。研究表明,宿主细胞TLRs在隐孢子虫的识别和宿主对隐孢子虫免疫应答方面起着重要作用。小肠作为微小隐孢子虫的主要寄生部位,然而关于微小隐孢子虫感染对肠道上皮细胞miRNAs和TLRs的影响尚未见报道。本研究旨在分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对细胞miRNAs和TLRs的影响。牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊分离纯化。本试验通过感染未食初乳荷斯坦奶牛,成功的对微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊进行了体外传代,感染第三天,出现拉稀症状,并开始排微小隐孢子虫卵囊,感染后第五到九天为排卵囊高峰期,排卵囊期为十五天;利用改良饱和食盐水漂浮法(饱和食盐水漂浮法+氯化铯密度梯度离心法),成功分离纯化了牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊,最终得到了牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型高纯度的3.5×10~8个卵囊,其脱囊率为76%,可用于下一步细胞感染试验。微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染对HCT-8细胞miRNAs的影响。本实验室利用miRNA芯片技术,分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染(4 h和12 h)对HCT-8细胞miRNAs的影响,结果发现感染4 h共有7个表达差异显著miRNAs(1个显著上调和6个显著下调);感染12 h共有13个表达差异显著miRNAs(3个显著上调和10个显著下调)。挑选6个miRNA芯片分析表达差异显著的miRNAs:hsa-miR-122-5p(4 h显著上调)、hsa-miR-3591-3p(4 h显著下调)、hsa-miR-454-5p(4 h显著下调)、hsa-miR-5580-3p(12 h显著上调)、hsa-miR-181d-3p(12 h显著下调)和hsa-let-7b-3p(12 h显著下调),利用qPCR相对定量方法分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对上述6个miRNAs的影响。结果显示,qPCR技术相对定量方法与miRNA芯片技术分析的结果相吻合,证明miRNA芯片分析的结果可靠。miRNAs靶基因预测及GO分类和KEGG通路分析。利用Targetscan human7.1和miRDBR分别预测20个表达差异显著的miRNAs的靶基因,只有18个表达差异显著miRNAs能被TargetScanHuman7.1和miRDB进行靶基因预测并取交集,结果显示,表达差异显著miRNAs的靶基因数量从10个到1034不等。利用DAVID分析方法对靶基因进行注释,并用GO分类的方法对每个miRNA靶基因进行功能分析,发现表达差异显著miRNAs参与的生物学过程有调节转录过程、细胞黏附、调节细胞凋亡、参与炎症应答、天然免疫反应、适应性免疫反应、钙离子的平衡、钾离子的转运、调节蛋白磷酸化/去磷酸化、调节干扰素的合成和酪氨酸激酶跨膜蛋白信号通路等(P<0.05);细胞组成成分主要有细胞膜、顶端质膜、线粒体膜等(P<0.05);分子功能主要有蛋白质结合、ATP激活、RNA聚合酶Ⅱ转录因子激活、肿瘤坏死因子受体激活、蛋白运输、钙离子通道激活、丝氨酸激酶激活、蛋白酶K激活等(P<0.05),hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-942-5p、hsa-miR-6721-5p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-3976和hsa-miR-3121-5p可以调节细胞凋亡过程,hsa-let-7b-3p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-6721-5p和hsa-miR-3121-5p可以调节小肠上皮细胞免疫反应。对表达差异显著的miRNAs进行KEGG通路分析,发现表达差异显著miRNAs可以调节与免疫相关的肿瘤坏死因子信号通路、趋化因子受体相互作用、炎症介质的TRP的调控信号通路和干扰素信号通路;与凋亡相关的p53信号通路、MAPK和ErbB信号通路;与细胞骨架重排相关的的肌动蛋白细胞骨架和Wnt信号通路;与入侵相关的细胞粘附分子;与离子转运调节相关的钙/钾离子信号通路等。利用Cytoscape 3.4.0建立miRNAs-靶基因网络图,发现hsa-miR-34b-5p和hsa-miR-3591-3p为感染4 h表达差异显著的核心miRNAs,hsa-miR-942-5p、hsa-let-7b-3p和hsa-miR-6721-5p为感染12h表达差异显著的核心miRNAs。微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染对HCT-8细胞TLRs的影响及生物信息学分析表达差异显著的miRNAs和TLRs的关系。微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊感染HCT-8细胞后,提取感染4 h和12h细胞的总RNA,利用qPCR相对定量方法对TLR1~TLR10的表达情况进行分析。结果显示TLR1~TLR10 mRNA在HCT-8细胞中均有表达,且TLR2和TLR4 mRNA在微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊感染4 h和12 h均显著上调。通过生物信息学分析发现,下调的miR-34b-5p、miR-454-5p、miR-3591-3p、miR-4685-3p、miR-18b-3p miR-3976、miR-1256、miR-1287-3p、miR-3121-5p、miR-6721-5p和let-7b-3p会通过上调TLR信号通路相关靶基因,进而可能会增加IFNα、IFNβ、IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌量,有利于宿主清除微小隐孢子虫;上调的miR-942-5p会抑制TLR信号通路相关靶基因CHUK、MAPK10、PIK3CD及TAB2的表达,进而可能会减少IFNα、IFNβ、IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌量,有利于虫体的入侵。通过分析表达差异显著miRNA与TLR2和TLR4互作蛋白的关系,免疫相关的TRAF3为miR-6721-5p的靶基因,DNA结合蛋白HMGB1为let-7b-3p的靶基因。综上所述,微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊感染会导致小肠上皮细胞miRNAs表达谱改变;表达差异显著的miRNAs在微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊感染宿主细胞早期可能发挥重要的生物学功能,并影响微小隐孢子虫在宿主细胞内早期的繁殖;TLR2和TLR4的显著上调可能与小肠上皮细胞对微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊的识别和免疫反应有关;表达差异显著的miRNAs对TLR信号通路可能发挥着重要的免疫调控作用。