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目的:研究梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)金属蛋白酶Tp0751对细胞外基质(ECM)纤维蛋白原(Fg)的水解能力及其机制,为深入研究Tp的致病机制提供实验依据。方法:(1)Tp0751野生型和突变型蛋白原核表达、纯化:从Genbank上查获Tp0751的基因序列(不含信号肽氨基酸编码序列),构建野生型p ET30a(+)/Tp0751、p ET30a(+)/Tp0751 H198A突变型和p ET30a(+)/Tp0751 H202A突变型蛋白原核表达重组载体,重组质粒在经双酶切、PCR和测序鉴定后被转化到BL21表达菌中进行重组蛋白的诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定经Ni-NTA纯化的目的蛋白的表达形式,BCA法测定蛋白的浓度;Western blot鉴定经Ni-NTA纯化的目的蛋白。(2)野生型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。(3)H198A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将H198A突变型Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测H198A突变型Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。(4)H202A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将H202A突变型Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测H202A突变型Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。结果:(1)Tp0751蛋白原核表达、纯化:酶切及测序结果表明重组野生型p ET30a(+)/Tp0751质粒的插入片段序列与Gen Bank上面公布的序列完全一致,经两点法构建的突变型重组质粒构建成功;该插入片段能够表达26KDa大小的可溶性重组蛋白,该重组蛋白经纯化后的纯度达到90%;该重组蛋白的Western blot结果表明,其与梅毒阳性病人的免疫血清产生特异性的免疫反应。(2)Tp0751蛋白对Fg水解能力检测:Tp0751蛋白具有水解Fg的能力,在反应持续24小时后Fg基本上被水解完全。(3)H198A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:H198A突变型Tp0751蛋白具有一定的水解Fg能力,在反应持续24小时后Fg部分被水解。(4)H202A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:H202A突变型Tp0751未表现出明显的水解Fg的能力,在反应持续24小时后Fg基本未被水解。结论:(1)Tp0751重组蛋白具有水解Fg的能力;(2)Tp0751蛋白HEXXH域的突变能抑制Tp0751蛋白降解Fg的能力;H198EXXH202结构域中影响Tp0751蛋白降解Fg的位点可能是202位的H而不是198位的H。