丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号系统是细胞内主要的信号转导系统，担负着将细胞外各种有丝分裂和应急信号传递至细胞核，并调节细胞基因表达介导细胞产生反应的重要使命。p38MAPK通路是MAPK信号系统的重要分支。1993年人们在研究细菌内毒素(lipopolysaccharide，LPS)诱导蛋白质的酪氨酸磷酸化时，发现在分子量38KD处有一条被磷酸化的蛋白带，并将该蛋白命名为p38。随后，韩家淮等克隆了p38基因，经对其结构与功能的研究，确定为哺乳动物丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的成员。研究证明，p38激酶在炎症和应急反应、细胞生长与凋亡、细胞周期及缺血／再灌等重要的生理、病理过程中具有重要作用。P38MAPK的激活涉及到细胞生长、细胞周期、细胞凋亡，参与炎症和应急反应的调控、转录因子的调控、细胞骨架重组，同时也参与感染性疾病、缺血／再灌注损伤、心肌肥大、神经元病理学、创伤愈合和组织重塑等疾病过程。 p38具有广泛而复杂的生物学作用，其信号转导的机制仍有待进一步揭示。深入研究p38激酶的信号转导机制，有助于阐明内毒素休克等重大疾病的发病机制，并为筛选这些疾病的治疗药物提供新的思路和新的靶点。 细胞内的信号转导通过细胞内系列生化事件的级联放大效应传递，主要包括蛋白质磷酸化、蛋白质—蛋白质相互作用形成信号复合物引起基因表达的诱导和／或抑制，最终导致细胞生长、分化和细胞结构等功能的变化。因此研究蛋白质的相互作用等生物大分子信号复合物成为目前P38丝裂原活化蛋白激酶作用蛋白质的筛选、鉴定与初步研究信号转导研究的重点。如果进一步对各种信号传导通路中的所有传导分子给予确定，明确各生物大分子信号复合物的分子组成，我们将可能对信号通路各分子所构成的错综复杂的网络系统具备更全面的认知。因此，认识与p38激酶相作用结合的蛋白质不仅有助于阐明p38激酶信号转导途径中由传导子所组成的蛋白质群，而且有助于揭示可能和p38激酶产生相互作用的新关系。 生物质谱技术和蛋白质组学技术的发展及其与其他生化手段的有效结合，使得对极微量样本进行蛋白质的分离与鉴定变得相对容易得多，这种技术上的进步为研究蛋白质提供了无可比拟的强大手段，对深入研究信号分子成为可能。我们在试验设计中将生物质谱技术与蛋白质免疫共沉淀试验有效结合，通过蛋白质免疫共沉淀试验得到与靶标蛋白p38共沉淀下来的蛋白质复合物，经过电泳分离后，由生物质谱鉴定，绘出能够与p38激酶结合的蛋白质谱。 实验证实这种方法简便而有效。经LPS刺激后的内毒素休克组或失血性休克组和对照组组织裂解液，通过纯化的p38重组蛋白亲和柱，能够与p38激酶结合的蛋白质得以共沉淀分离。随后进行一维凝胶电泳 (sodium dodecyt SulPhate一polyacrylaJ叮lde gel elec加Phoresis，SDS-P AGE)分离，显色。再在胰酶胶内酶解基础上，应用生物质谱 (matrix.asslsted laser desorptio可ioaization一t五ne of flight.masssPectrometly，MALDI一TOF Ms)鉴定分离出来的蛋白质群。结果发现休克组肺组织有两条蛋白带发生显著变化，在体外与p38直接结合，经肤质谱图鉴定为c一反应蛋白(c一~tive protein，CRP)和内源性p38;休克动物心脏组织有两种蛋白能够与p38相互作用，经鉴定其中一种为三磷酸腺昔(adenosine城phosPhate，ATP)合成酶Q链。 随后，我们观察了CRP在内皮细胞(endothelial。ell，EC)中的表达定位，发现静息状态下的细胞CRP主要分布在细胞膜皮质区，分布均匀，边缘光滑，细胞核内有较弱均匀染色;经LPS刺激30 min后，细胞CRP细胞核周边染色增强，核内出现点状荧光增强颗粒;lh后，内皮细胞膜皮质区的CRP出现点状致密染色斑，向外扩散，细胞膜变得模糊不清，胞浆内分布不均匀;12h后，细胞胀大，细胞形态模糊不清，细胞外周边区域出现荧光染色。说明LPS刺激能够引起CRP入核，并且形态学发 6p38丝裂原活化蛋白激酶作用蛋白质的筛选、鉴定与初步研究生变化，呈点状聚集。而LPS刺激对细胞内CRP表达量无显著影响。 同时我们还克隆了带有GsT(glutathione一s一枉妞nsferase，GsT)标记的人C一反应蛋白(恤叨曲C一reactive Protein， hCRP)表达载体pPGEX一KG/hC即质粒和带有HA标记的pcDNA3/ HA一hcRP表达质粒。前者与纯化的p38进行体外结合实验，证实二者在体外能够相互作用;后者与Flag标记的peDNA3/ Flag一p38共转染细胞进行体内蛋白免疫共沉淀(Co一nnmunopreeipitation，Co一Ip)实验，结果进一步证实e即与p3s在体内产生相互作用。说明cRP参与了休克过程中p38信号转导通路。 综上所述，我们通过研究休克模型信号转导通路中与p38激酶结合的蛋白质群，深入地认知p38激酶的相互作用分子，发现了与p38信号分子有结合关系的CRP，并证实了二者在体内、外发生相互作用，为进一步阐明休克等重大疾病的发病机制，筛选其治疗药物提供实验基础。本课题是目前国际上首次在体研究p38激酶的结合蛋白质群，包括其在