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第一部分遗传性凝血因子Ⅴ/Ⅷ联合缺乏症的分子机制研究目的:凝血因子V/Ⅷ联合缺乏症(F5F8D)是一种罕见的出血性疾病,大多数患者有自发出血症状。本研究旨在对一例中国F5F8D家系进行基因检测,探讨其分子发病机制。方法:先证者为一名30岁女性,自述有月经过多和皮肤易青紫的症状,父母近亲结婚并无异常出血倾向。对患者及其父、母进行血常规、凝血四项、混合血浆纠正的APTT试验、内外源凝血因子活性及血浆vWF:Ag检测。根据检查结果,应用聚合酶链反应(PCR)扩增先证者FV基因(F5)或FⅧ基因(F8)、LMAN1及MCFD2基因的所有外显子和侧翼序列,并对扩增产物进行直接测序。测序结果应用Chromas软件与正常序列进行比对,根据先证者基因突变位点扩增其父、母相关基因位点并测序。应用Clustal-X2.1软件分析突变位点的保守性,Polyphen2、SIFT、Mutation Teasers、PyMOL软件分析突变结果对蛋白质结构功能的影响。结果:先证者的FV:C、FⅧ:C、PT、APTT和vWF:Ag分别为9.9%、5.9%、17s、75s和101.0%,混合血浆纠正试验示PT、APTT分别为为13.5s和31.1s,其余内、外源凝血因子活性均在正常范围内,诊断为凝血因子Ⅴ/Ⅷ联合缺乏症。其父、母凝血五项及各凝血因子活性均无异常。经测序发现,先证者MCFD2基因Exon4有纯合突变(c.398A>T),致 D133V,同时F8Exon14 杂合突变(c.5012G>A),致R1671H。LAMN1基因及F5基因均未发现突变。先证者母亲在MCFD2基因及F8的相同位点上存在这两种突变,且均为杂合突变;先证者父亲仅MCFD2基因有杂合突变(c.398A>T)。Clustal-X 2.1软件分析提示MCFD2基因翻译的蛋白Asp133为保守氨基酸,Polyphen2、SIFT、Mutation Teasers、PyMOL 软件分析显示 Val133突变导致蛋白质结构与功能改变。Clustal-X 2.1软件分析提示FⅧ蛋白的Arg1671 为非保守氨基酸。Polyphen2、SIFT、Mutation Teasers、PyMOL 软件分析显示c.5012G>A杂合突变与疾病的关联暂时无法明确。然而p.R1671H杂合突变曾被报道是一名重症血友病患者的分子发病病因,说明其影响FⅧ水平的可能性较大。结论:本研究中发现的MCFD2基因突变(c.398A>T,导致p.D133V)可能是导致先证者FⅤ/FⅧ联合缺乏的分子病理基础;F8突变(c.5012G>,导致p.R1671H)有可能会引起FⅧ水平降低。查阅数据库及中、外文献发现MCFD2基因c.398A>T突变为首次报道。需要进一步的研究以阐明基因突变如何干扰FV和FⅧ的合,成和分泌。第二部分凝血因子XI缺乏症的分子机制研究目的:对两例凝血因子XI(coagulation factor XI,FXI)缺乏症患者进行基因检测及突变分析,探讨其分子发病机制。方法:对两例患者进行活化部分凝血活酶时间(APTT)及纠正实验,凝血酶原时间(PT),国际标准化比值(INR)及凝血因子水平测定以进行表型判断。提取患者DNA,用PCR法扩增凝血因子XI的15个外显子及其侧翼的DNA序列,经过切胶纯化后直接测序,测序结果与正常基因序列比对筛选突变位点。对突变基因进行生物信息学软件分析,判断其对编码蛋白质结构功能的影响。结果:经检测两例患者APTT时间延长和FXI水平降低,病例1.APTT88.1s、FXI:C 1.10%;病例2.APTT107.1s、FXI:C3.8%,两例患者APTT混合血浆纠正试验分别为32.9s和31.9s。两例患者确诊为凝血因子XI缺乏症。测序结果提示患者1在F11基因有复合杂合突变g.1251-1G>A和g.1271delT,TA质粒克隆测序结果显示上述两种突变位于不同的染色体单链上。患者2则在F11基因有复合杂合错义突变g.1070A>G和g.1446C>G,分别导致p.L357R和p.C483X。经软件分析,两例患者FXI基因突变对FXI蛋白质的结构和功能产生影响的可能性较大。结论:本研究中发现的F11基因g.1251-1G>A与g.1271delT双杂合突变和g.1070A>G与g.1446C>G双杂合错义突变,可能分别是两例凝血因子XI缺乏患者的分子发病机制,与患者FXI水平显著降低和APTT明显延长有关。查阅中、外文献及FXI突变数据库发现这四种突变均为首次报道。