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在饲料中添加植酸酶可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收率,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染。在生产酶制剂的过程中提高植酸酶基因的表达水平以及改善植酸酶的稳定性是亟待解决的问题。随着基因工程的发展,在分子水平上对酶基因进行改造为改良酶蛋白开辟了一条新的途径。二硫键是蛋白质分子侧链间唯一的共价键,对蛋白质的结构稳定性及功能具有重要的作用。植酸酶PHYA中共含有五对二硫键( Cys12-Cys21 , Cys52-Cys395 , Cys196-Cys446 ,Cys245-Cys263,Cys417-Cys425),通过研究植酸酶分子中二硫键对酶的催化活性及稳定性的影响,找出影响稳定性的关键部位,可以为通过引入二硫键来提高酶的稳定性打下基础。本实验室前期研究已证明二硫键对植酸酶的空间结构和催化活性有重要作用,并利用定点突变技术对其中的3对二硫键进行了单突变缺失研究,初步结果表明其中两对对植酸酶的热稳定性有重要作用。为全面确定5对二硫键的作用,在已有的3个单突变体的基础上,又构建了另外6个突变体(包括4个单突变体和2个双突变体),结合前期得到的3个单突变体,研究5对二硫键的缺失对植酸酶的结构和功能的影响,得到的主要结果如下:1.对植酸酶酶促反应动力学性质的研究表明:二硫键Cys12-Cys21和Cys196-Cys446的缺失明显降低了植酸酶对底物的亲和力、催化效率和底物专一性,同时酶的最适pH也有所改变。二硫键Cys12-Cys21、Cys52-Cys395、Cys196-Cys446的缺失使植酸酶反应最适温度(反应时间10分钟)由50℃分别变为45℃、55℃、40℃。2.利用内源荧光光谱技术对野生型和突变体植酸酶的空间构象进行了研究,结果表明5对二硫键的缺失使植酸酶的空间结构发生了或多或少的改变,其中二硫键Cys52-Cys395的缺失使植酸酶空间结构变得尤为松散。3.对野生型和突变体植酸酶热稳定性分析表明,二硫键Cys52-Cys395、Cys245-Cys263、Cys417-Cys425的缺失极大地降低了植酸酶的热稳定性,二硫键Cys196-Cys446缺失以后得到的突变体植酸酶热稳定性比野生型略高。