在现代分子生物学研究领域中,无论研究的是已知还是未知基因,一般都需要将其克隆进合适的载体中,因此载体的选择至关重要。TA克隆技术的产生以及T载体的使用,克服了常规粘端和平端连接方式的缺陷,是一种特殊的粘端连接方式。但是目前市面上出售的商业化T载体大多利用IPTG诱导并通过蓝白斑筛选以获得所需要的转化子,转化子假阳性较高;另一方面,商业化T载体大多为克隆型T载体,基因表达功能弱;同时,由于外源基因插入T载体中时并非是定向的,如果反向插入则启动子无法启动其下游基因的表达,因此若使用TA克隆技术来表达目的基因,后续还需要鉴定基因插入方向,增加了筛选正确转化子的难度。这样便给表达型T载体的构建及应用带来了困难。本研究在现有T载体的基础上构建了一种新型的兼有分子克隆、表达、基因文库构建和基因产物活性筛选功能的T载体(pHsh-T),并对其应用进行了一些研究。本实验室自主构建的载体pHsh-Cm拥有单向的热激诱导型基因表达元件(Hshpro),首先对其进行序列分析,利用反向PCR突变其1874bp位置的限制性内切酶BfuⅠ酶切位点。随后依据E.coli σ70识别的启动子的保守序列设计一段用于反向启动基因表达的组成型启动子Hkgpro,并设计引物,利用反向PCR技术在载体上引入Hkg pro以及相应的核糖体结合位点(RBS)。在此基础上,设计了一个与Hkg pro相对应的不依赖于p因子的终止子Hkg term,利用反向PCR在上述质粒中加入反向转录终止子Hkgterm。再在启动子Hkgpro和Hshpro之间引入2个背向限制性内切酶Bfu Ⅰ的酶切位点,制备成前体质粒pre-pHsh-T。最后,利用Bfu Ⅰ对前体质粒进行切割,胶图上呈单一条带,表明pHsh-T载体构建成功。该载体拥有双向基因表达元件:原有的热激诱导型Hshpro启动子和终止子:本研究构建的组成型Hkgpro启动子和终止子。本实验室筛选到3株产胆固醇氧化酶的未知菌株,为了验证pHsh-T作为克隆载体的可行性,将3株的16S rDNA成功克隆到pHsh-T中,并利用该载体上的泛用引物测序了插入片段。经序列鉴定以及NCBI数据库比对表明3株菌株均与Geobacillus属内菌株的相似性为99%以上,要将其鉴定至种的水平还需要我们结合其它的生理生化特征以及化学分类学特征来进一步研究。这个结果说明pHsh-T可以作为克隆载体使用。为了验证pHsh-T作为双向表达载体的可行性,将嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus JW200)的还原力感应蛋白基因(RSP)及新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)的β-木聚糖酶基因(xyn)克隆进pHsh-T载体中,随机挑取平板上的转化子,结果均为正确插入靶基因的转化子。正反向表达实验结果表明,无论在Hsh pro还是在Hkg pro的调控下,蛋白都能得到有效表达。为了验证pHsh-T的宿主转化率,将RSP基因克隆进常用的pET-28a载体中,构建成质粒pET-RSP,并比较pHsh-RSP与pET-RSP的转化率。结果表明,在操作完全相同情况下,pHsh-RSP具有更高的转化效率。综合以上结果,pHsh-T载体具有易于克隆和高效表达的功能,表达无需化学诱导剂,降低诱导成本,适合工业酶以及药用蛋白的生产。同时该载体具有双向基因表达元件,使正、反向连接的外源基因均能得到有效表达,适用于基因文库的构建和基因产物的活性筛选。为了验证pHsh-T作为构建基因文库载体的可行性,用Sau3A Ⅰ部分酶切T.ethanolicus JW200基因组,分离回收合适长度的片段,利用Taq DNA聚合酶在回收得到的片段的粘性末端补平加A。理论转化子个数为6900个,转化后获得9000个克隆,是理论克隆数的1.3倍。该结果说明pHsh-T完全可以作为构建基因文库的载体。随后尝试与另外一个已经构建完成的报告载体pTrc99A-ap进行联合作用,建立一套可用于筛选特定启动子的阻遏蛋白的蓝白筛选方法,该方法还需进一步的研究验证。