背景和目的食管癌是全世界范围内致死率第六位的恶性肿瘤,可以分成两种主要的类型,即食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EA),在中国主要的食管癌类型是食管鳞癌。近年来食管鳞癌的发病率呈现逐年增加的趋势,但其预后却不乐观,同时食管鳞癌的术后5年生存率居高不下。因此研究其发病机制,寻找早期诊断及治疗的靶点显得尤为重要。DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)是重要的抗肿瘤屏障,抵抗机体内部或者外部的基因毒性压力,维持基因组的完整性。DNA损伤反应过程主要是启动一系列的“DNA损伤检测点”通路,这条通路由感受元件、传导元件和效应元件组成。作为DNA损伤反应重要的效应原件之一,转录因子E2F1因为能够参与调控DNA损伤反应过程中的细胞周期G1/S阻滞和细胞凋亡过程,近年来在DNA损伤反应中的地位越来越突出。虽然p53也具有这两方面的作用,但是大多数的肿瘤细胞p53基因是突变的。因此,E2F1显得更为重要。E2F1是转录因子E2Fs家族中的一员,E2Fs是肿瘤抑制因子p Rb的下游效应因子,决定了众多进入并通过细胞周期S期基因的顺序表达。现在证明E2Fs还可以调控众多细胞学行为,包括DNA合成和复制、有丝分裂检测点的控制、DNA损伤修复、自我更新,以及发育和分化等。E2F1是E2Fs家族最先发现和研究最广泛的基因,还可以调控细胞凋亡和自噬反应。在人类肿瘤中,Rb介导的E2Fs的抑制常常由于各种机制受到破坏,这些改变导致E2Fs的异常释放,从而诱导E2Fs靶基因的转录激活,最终导致细胞异常。已有研究发现E2F1在众多肿瘤包括食管鳞癌中表达失调。在食管鳞癌中,E2F1的表达与生存率低和较差的组织分期相关。但是除了表达方面的研究之外,关于E2F1在食管鳞癌中的功能的研究却很少,因此深入探讨E2F1在食管鳞癌中的功能及其具体机制具有重要的意义。微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)是一类长度为21-23nt的非编码小RNAs,在转录后水平负向调控基因的表达。mi RNAs几乎参与体内所有的生物学过程,与此同时,研究发现mi RNAs在人类肿瘤中表达失调。mi RNAs可通过靶向调控癌基因或者抑癌基因通路相关基因如p53、Myc、E2F1、Ras,和BCL-ABL等等发挥作用,其表达也可以被多种癌基因或者抑癌基因包括E2F1所转录调控。E2F1上调的mi RNAs,可以反过来通过直接靶向或者间接抑制E2F1的表达作为E2F1通路的负反馈调控因子,维持细胞稳态。此外,在DNA损伤反应中,mi RNAs既可以靶向调控DNA损伤反应通路的相关基因ATM、ATR、Chk1,Chk2等,同时又可以被这些基因包括E2F1所转录调控。但是,在食管鳞癌中至今未见有E2F1调控mi RNAs参与DNA损伤反应的研究报道。已有文献报道,mi R-203和mi R-26b在肿瘤中发挥抑癌基因的作用。在不同的肿瘤中mi R-203和mi R-26b可以通过调控不同的靶基因调控细胞周期阻滞或者细胞凋亡。但是这两种mi RNAs是否参与DNA损伤反应,迄今为止没有人研究。同时,对于这两种mi RNAs的表达调控的报道也较少。我们通过生物信息学分析,发现在mi R-203基因和mi R-26b的主基因CTDSP1的启动子区Cp G岛内存在E2F1的结合位点,它们可能受到E2F1的调控。本课题旨在探讨食管鳞癌细胞中E2F1调控mi R-203和mi R-26b表达的分子机制,以及他们在食管鳞癌细胞生长和DNA损伤反应中的功能。本课题的主要研究内容和结果如下:1.顺铂对食管鳞癌细胞中mi R-203的诱导作用依赖于E2F1的表达1.1采用Western blot和q RT-PCR的方法检测顺铂作用于食管鳞癌细胞后,γ-H2X和E2F1的表达,以及mi R-203表达的时间效应和浓度梯度效应。结果发现,顺铂处理食管鳞癌细胞EC109和Kyse450后,γ-H2X的表达增加,说明发生了DNA损伤反应。在E2F1蛋白表达上调的同时,mi R-203的表达也相应升高。此外,顺铂对mi R-203的诱导作用具有时间和浓度梯度效应。研究结果提示mi R-203在顺铂诱导的食管鳞癌细胞DNA损伤反应中表达增加,而这种表达效应可能与E2F1的表达相关。1.2分别采用Western blot和q RT-PCR的方法检测在食管鳞癌细胞中过表达或者干扰E2F1的表达后,E2F1和mi R-203的表达变化。实验结果显示,在食管鳞癌细胞EC109和Kyse450中过表达E2F1后,mi R-203表达增加。而干扰食管鳞癌细胞EC109和Kyse450中E2F1的表达后,在E2F1表达降低的同时,γ-H2X的表达降低,说明顺铂诱导的DNA损伤反应与E2F1的表达相关。更重要的是,E2F1的表达降低阻断了顺铂对mi R-203的诱导作用。这些结果证明在食管鳞癌细胞中顺铂对mi R-203的诱导作用是由E2F1介导的。1.3通过荧光素酶报告基因实验和Ch IP实验研究E2F1对mi R-203的转录调控及相关机制。通过生物信息学的方法,我们在mi R-203转录起始位点上游发现三个潜在的E2F1结合位点,分别是-501/-486(BS1)、-439/-449(BS2)和-202/-194(BS3)。荧光素酶报告基因实验显示过表达E2F1显著上调含有三个结合位点的报告基因载体的转录活性,缺失BS2后,荧光素酶的结合活性几乎完全消失。Ch IP实验结果显示,E2F1与含有BS2的扩增片段结合,而顺铂的处理又显著增强了这种结合能力。这些结果证明了转录因子E2F1直接结合到mi R-203基因的启动子区的BS2位点,并在转录水平上调mi R-203的表达水平。2.mi R-203对食管鳞癌细胞生物学功能的影响2.1通过q RT-PCR和CCK8技术检测mi R-203在食管鳞癌细胞中的表达以及mi R-203对食管鳞癌细胞增殖的影响。通过对四种食管鳞癌细胞株中mi R-203的基础表达水平进行检测,我们发现mi R-203在EC109细胞中表达最低,在EC9706细胞中表达最高,过表达mi R-203 mimics对EC109细胞生长具有显著的抑制作用。2.2通过流式细胞技术和Annexin V-FITC技术检测mi R-203对食管鳞癌细胞周期以及细胞凋亡的作用。我们发现与对照NC相比,在EC109细胞中过表达mi R-203能够诱导细胞在G1期的显著聚集,与此同时S期细胞比例显著降低。相反,在EC9706细胞中阻断mi R-203的表达后,G1期细胞的比例显著降低,而G2/M期和S期细胞显著增加。结果提示mi R-203可以抑制细胞周期G1/S期周期转换。此外,我们发现mi R-203对食管鳞癌细胞凋亡没有影响。说明mi R-203对食管鳞癌生长的抑制作用是通过调控细胞周期而非细胞凋亡实现的。2.3通过Western blot技术检测在食管鳞癌细胞EC109或者Kyse450中过表达mi R-203mimics后CDK6、p Rb和E2F1的表达变化。结果发现,mi R-203抑制了食管鳞癌细胞中CDK6、p Rb和E2F1蛋白的表达。结果提示可能mi R-203通过抑制CDK6的表达作用于p Rb蛋白,并最终使E2F1的表达降低。因此,食管鳞癌细胞中mi R-203与E2F1之间可能通过CDK6形成了一个负反馈调节的环路。3.顺铂对食管鳞癌细胞中mi R-26b的诱导作用依赖于E2F1的表达3.1通过q RT-PCR技术检测采用不同浓度或者不同时间点的顺铂处理食管鳞癌细胞后,mi R-26b的表达情况。结果发现顺铂处理食管鳞癌细胞EC109和Kyse450后,mi R-26b的表达升高,同时顺铂对mi R-26b的诱导表达具有时间效应和浓度梯度效应。结合之前的结果——顺铂诱导EC109和Kyse450细胞中E2F1和γ-H2X的表达,提示mi R-26b在顺铂诱导的食管鳞癌细胞DNA损伤反应中表达增加,而这种表达效应可能与E2F1的表达相关。3.2采用定量RT-PCR技术检测在食管鳞癌细胞中过表达E2F1后mi R-26b的表达;干扰食管鳞癌细胞中E2F1的表达后,加顺铂处理,检测mi R-26b的表达。结果发现在食管鳞癌细胞EC109和Kyse450中过表达E2F1后,mi R-26b的表达升高;干扰这两种细胞中E2F1的表达后,阻断了顺铂对mi R-26b的诱导作用。结果提示在食管鳞癌细胞中顺铂对mi R-26b的诱导作用是由E2F1介导的。4.mi R-26b对食管鳞癌细胞生物学功能的影响4.1通过定量RT-PCR技术检测mi R-26b在33例食管鳞癌组织及其邻近正常组织中的表达情况,结果发现mi R-26b在33例食管鳞癌组织中的表达显著低于临近正常组织。4.2通过CCK8和流式细胞技术检测mi R-26b对食管鳞癌细胞生长和细胞周期的作用。结果发现,mi R-26b可以显著抑制食管鳞癌EC109细胞的生长。在EC109细胞中过表达mi R-26b能够诱导细胞在G1期的显著聚集,相反在EC9706细胞中阻断mi R-26b的表达后,G1期细胞的比例显著降低,结果提示mi R-26b可以诱导食管鳞癌细胞周期G1/S期细胞阻滞。4.3运用流式细胞技术检测不同时间点顺铂处理食管鳞癌细胞后,细胞周期的变化;阻断食管鳞癌细胞中mi R-26b的表达后,对顺铂诱导的细胞周期的影响。结果发现,分别在不同时间点采用顺铂处理食管鳞癌细胞Kyse450后,G1期细胞比例都显著增加,S期细胞比例显著降低,而G2期细胞几乎没有变化。在Kyse450细胞中阻断mi R-26b的表达后,再加顺铂处理,G1期细胞比例没有增加,反而降低。结果提示顺铂能够诱导食管鳞癌细胞周期G1/S期阻滞,而这种作用依赖于mi R-26b的表达。4.4采用Western blot技术检测食管鳞癌细胞中过表达mi R-26b后,Rb、ATM及E2F1的表达变化。结果发现在食管鳞癌细胞中过表达mi R-26b可以抑制ATM、Rb和E2F1的表达。结果提示ATM和Rb可能是mi R-26b的靶基因,同时mi R-26b可能通过Rb或者ATM作用于E2F1的表达,形成了一个负反馈调节通路。综上所述,我们的研究结果显示在食管鳞癌细胞中E2F1能够转录调控mi R-203和mi R-26b的表达,反过来,mi R-203和mi R-26b又分别通过不同的下游基因反作用于E2F1,提示mi R-203和mi R-26b为E2F1调控网络的新成员。E2F1调控mi R-203和mi R-26b诱导了细胞周期G1/S阻滞,即可影响食管鳞癌细胞的生长,又参与了顺铂诱导的食管鳞癌细胞DNA损伤反应,他们可能是在DNA损伤早期参与DNA损伤检测点的监控。本课题初步揭示了E2F1诱导mi RNAs参与食管鳞癌生物学功能的调控,有助于深入理解食管癌的发生发展的机制并为食管鳞癌的治疗提供依据。