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研究背景多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种浆细胞异常增殖并产生大量单克隆免疫球蛋白的血液系统恶性肿瘤。近年来,随着蛋白酶体抑制剂硼替佐米和免疫调节剂来那度胺的应用,MM患者预后得到明显改善,其中位生存期可达5-7年。但是MM仍然是一种不可治愈的疾病。而随着以程序性死亡受体-1/配体-1（PD-1/PD-L1）为代表的免疫检查点抑制剂的兴起和以靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）为代表的细胞治疗的出现,MM患者的治疗可能进入免疫治疗新时代。可惜的是,CAR-BCMA-T细胞治疗的MM患者即使得到完全缓解,部分患者最终复发难治,而派姆单抗（Pembrolizumab）联合治疗的临床试验,包括KEYNOTE-185和KEYNOTE-183,更是因为较高的致死率而被美国药监局（FDA）临时叫停。因此,新的联合治疗应用方案仍需进一步探索。本课题组前期研究发现,MM患者骨髓微环境中具有较高比例的巨噬细胞（macrophage,MΦs）,并可促进MM细胞增殖,保护MM细胞免受化疗诱导的凋亡。因此,我们认为巨噬细胞也可能在介导MM细胞在肿瘤微环境的免疫逃逸中发挥重要作用。进一步的,我们研究发现MM细胞可诱导巨噬细胞表达成纤维相关激活蛋白（fibroblast associated proteinα,FAPα）。同时,在骨髓瘤患者中,FAPα+巨噬细胞比例随着CD138+MM细胞比例增高而增加。因此,本实验在前期研究的基础上进一步探究巨噬细胞上表达FAPα在介导MM细胞免疫逃逸中发挥的作用,并探讨FAPα发挥免疫抑制功能的具体机制,为临床上免疫治疗联合应用方案提供新的思路。研究目的1.体外验证巨噬细胞上表达FAPα并明确其在巨噬细胞上其发挥的功能。2.体外验证FAPα+巨噬细胞对T细胞的抑制功能及相关作用机制。3.动物实验验证FAPα抑制剂和PD-1/PD-L1单抗的联合应用效果及相关机制。4.临床患者数据验证体外及动物实验结果研究方法1.流式细胞术（FCM）和Western blot检测与MM细胞共培养或细胞因子TGFβ1、MCSF处理后巨噬细胞上FAPα的表达,免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）检测FAPα在MM患者中的表达2.RNA-seq、RT-q PCR、Western blot、FCM、IF检测巨噬细胞过表达和敲减FAPα后其上表面分子PD-L1的改变,Western blot检测巨噬细胞上过表达和敲减FAPα后,PD-L1调控相关通路改变及PD-L1糖基化、泛素化和自噬调控改变。流式细胞术检测T细胞与巨噬细胞共培养后凋亡改变。3.巨噬细胞过表达和敲减FAPα后与CD4+/CD8+T细胞共培养,荧光倒置显微镜观察T细胞SA-β-gal改变,流式检测共培养后T细胞上SA-β-gal、表面分子（CD28、PD-1）、胞内因子（IFNγ、IL-4、IL-17A、IL-22、IL-9、IL-10、IL-21、颗粒酶B）表达改变。用重组人FAPα重组蛋白直接处理CD4+/CD8+T细胞,流式细胞术检测T细胞上SA-β-GAL、表面分子和胞内因子的改变。4.构建FAPα点突变慢病毒载体及对照慢病毒（NC、WT、A657D、A657Q、A657F）,其表达FAPα二肽酶和内切酶活性不同。慢病毒转染HEK293T细胞,嘌呤筛选获得稳定过表达FAPα不同突变细胞株,获取细胞株培养上清培养CD4+/CD8+T细胞,流式细胞术检测T细胞上表面分子和胞内因子改变。将FAPα抑制剂处理巨噬细胞并与MM细胞和CD3+T细胞共培养,CD3+T细胞用CD3/CD28磁珠活化,联合或不联合PD-L1单抗、PD-1单抗、CTLA4单抗,流式细胞术检测CD138+MM细胞凋亡。5.C57BL/Ka Lw Rij小鼠皮下注射5TGM1细胞株,构建MM皮下荷瘤小鼠。瘤旁注射氯磷酸盐脂质体及对照脂质体,腹腔注射小鼠PD-L1单抗、PD-1单抗或相应对照,观察并记录小鼠瘤体体积变化。取小鼠瘤体样本,IHC染CD138、F4/80、CD4和CD8,并采用累积光密度值（IOD）半定量计算瘤体CD138+细胞、巨噬细胞和T细胞浸润情况。构建MM皮下荷瘤小鼠,FAPα抑制剂联用或不联用PD-L1/PD-1单抗,观察小鼠瘤体变化。IHC染色及IOD分析小鼠瘤体CD138、F4/80、CD4、CD8、FAPα、PD-L1、IFNγ、颗粒酶B表达情况,验证FAPα作用机制。6.在TCGA数据库中分析FAPα表达与泛癌PFS和OS的相关性,分析FAPα在不同肿瘤免疫分型中的相对表达,分析FAPα在不同肿瘤中的相对表达,分析FAPα在不同肿瘤中的表达与肿瘤微环境中各组分含量的相关性。7.分别构建EL4、CT26、Hep1-6、4T1皮下荷瘤小鼠模型,FAPα抑制剂联用或不联用PD-L1/PD-1单抗,观察小鼠瘤体变化。IHC染色及IOD分析小鼠瘤体各指标变化情况,进一步验证FAPα抑制剂与PD-L1/PD-1单抗联用在不同肿瘤模型中所起的作用。8.获取不同阶段MM患者骨髓样本,离心分离骨髓上清,沉淀细胞采用密度梯度离心获取单个核细胞,流式检测不同阶段MM患者中CD138+MM细胞、FAPα+巨噬细胞、CD4+/CD8+T细胞及其各细胞亚群所占比例,并分析其中相关性。ELISA检测不同阶段MM患者样本上清中各细胞因子含量并分析其中相关性。获取MM患者初发及复发时骨髓活检样本,IHC染色及IOD半定量分析MM患者初发及复发时各指标表达情况,并结合患者临床预后,分析其中相关性。研究结果1.巨噬细胞上FAPα的表达。Western blot结果显示TGFβ1和MCSF均可诱导巨噬细胞表达FAPα,MM细胞可分泌TGFβ1和MCSF以诱导巨噬细胞上FAPα表达。IHC和IF示MM患者样本中存在FAPα表达。2.FAPα诱导巨噬细胞上PD-L1的表达进而诱导T细胞凋亡。RNA-seq示巨噬细胞过表达FAPα后PD-L1改变。RT-q PCR、Western blot、FCM、IF示巨噬细胞上过表达FAPα后PD-L1表达上升,敲减FAPα后PD-L1表达下降。Western blot示巨噬细胞上过表达或敲减FAPα后PD-L1调控通路改变。Western blot示巨噬细胞上过表达FAPα后糖基化PD-L1增高,PD-L1自噬减少,敲减FAPα后,PD-L1自噬增加。FCM示巨噬细胞上过表达FAPα后诱导CD4+/CD8+T细胞凋亡增加,敲减FAPα后诱导CD4+/CD8+T细胞凋亡减少（p＜0.05）。3.FAPα+巨噬细胞对T细胞表面分子、胞内因子的影响。荧光显微镜和FCM示巨噬细胞上过表达FAPα可诱导CD4+/CD8+T细胞上SA-β-gal表达增加,敲减FAPα后T细胞上SA-β-gal表达下降。FCM示巨噬细胞上过表达FAPα后使CD4+/CD8+T细胞表面活化分子CD28表达减少（p＜0.05）,PD-1表达无明显差异,IFNγ表达增加而CD8上颗粒酶B表达减少（p＜0.05）。敲减FAPα后结果与上述一致。4.重组人FAPα蛋白（h FAP）对T细胞表面分子、胞内因子的影响。荧光显微镜和FCM示CD4+/CD8+T细胞用h FAP处理后SA-β-gal表达增高。FCM示CD4+/CD8+T细胞用h FAP处理后,CD28表达减少,IFNγ表达增加,颗粒酶B表达减少（p＜0.05）。RNA-seq示CD4+/CD8+T细胞用h FAP处理后颗粒酶B表达减少。5.FAPα不同酶活性对T细胞表面分子、胞内因子的影响。Western blot示HEK293T细胞成功转染慢病毒。WT上清使CD4+/CD8+T细胞上CD28、IFNγ、颗粒酶B表达均下降（p＜0.05）,随着FAPα上二肽酶及内切酶活性下降,上清处理后的CD4+/CD8+T细胞上CD28、IFNγ、颗粒酶B表达逐渐上升（p＜0.05）。6.体外验证FAPα抑制剂PT100和PD-l/PD-L1单抗联用效果。无巨噬细胞共培养组,PD-l、PD-L1、CTLA4单抗可以促进CD3+T细胞对CD138+MM细胞的杀伤,有巨噬细胞共培养时,各单抗处理组CD138+MM细胞凋亡明显减少（p＜0.05）。而FAPα抑制剂PT100联合PD-l/PD-L1单抗处理组相较于各单独处理组,CD138+MM细胞凋亡增加（p＜0.05）。7.动物实验验证巨噬细胞对PD-1单抗疗效的抑制作用。动物实验示PD-L1单抗单独处理组相较于对照组小鼠瘤体缩小（p＜0.05）而PD-1单抗单独处理组相较于对照组无显著差异（p＞0.05）。用氯磷酸盐脂质体和PD-L1单抗联用组效果与PD-L1单抗单用组无显著差异（p＞0.05）,而氯磷酸盐脂质体和PD-1单抗联用组小鼠瘤体显著小于PD-1单抗单用组（p＜0.05）。IHC和IOD示氯磷酸盐脂质体相较于对照组显著减少小鼠瘤体F4/80+巨噬细胞含量（p＜0.05）,氯磷酸盐脂质体和PD-1单抗联用组小鼠相较于PD-1单抗单用组F4/80+巨噬细胞含量下降,CD4+T、CD8+T细胞含量上升。而PD-L1单抗本身相较于对照组即可显著减少小鼠瘤体中巨噬细胞含量,促进CD4+T、CD8+T细胞浸润（p＜0.05）,PD-L1单抗单用组和联合用药组相比无显著差异（p＞0.05）。8.动物实验验证FAPα抑制剂PT100和PD-L1/PD-1单抗联用对5TGM1荷瘤小鼠模型作用。小鼠瘤体示PT100单独使用组相较于对照组小鼠瘤体缩小（p＜0.05）。PT100和PD-L1单抗联用组小鼠相较于PD-L1单抗单用组小鼠瘤体有减小,但并无显著差异（p＞0.05）。PT100和PD-1单抗联用组小鼠相较于PD-1单抗单用组小鼠瘤体显著下降（p＜0.05）。IHC和IOD示PD-L1单抗单用组小鼠瘤体相较于对照组巨噬细胞含量显著降低,IFNγ含量显著上升（p＜0.05）。PT100单用组以及与PD-L1/PD-1单抗联用组小鼠瘤体内巨噬细胞含量显著降低（p＜0.05）,FAPα表达显著下降（p＜0.05）,颗粒酶B分泌显著增高（p＜0.05）。9.数据库中FAPα表达及相关性分析。TCGA数据库分析示FAPα高表达组相较于低表达组其PFS和OS更低（p＜0.05）。在肿瘤免疫分型中,TGFβdominant组FAPα表达水平相对最高,其次是Wound Healing组和IFNγdominant组。而在不同的肿瘤组织中,胰腺癌中FAPα表达最高,其次是侵袭性乳腺癌,弥漫大B细胞淋巴瘤、结肠癌、肝细胞肝癌等逐渐下降,在胸腺瘤中表达最低。此外,在大部分肿瘤组织中,FAPα表达与巨噬细胞含量,尤其是M2亚型巨噬细胞含量呈正相关,与CD8+T细胞和NK细胞含量呈负相关,其相关性具有统计学意义（p＜0.05）。10.动物实验验证FAPα抑制剂PT100和PD-L1/PD-1单抗联用在其他肿瘤小鼠荷瘤模型中的作用。在CT26小鼠皮下荷瘤模型中,PT100和PD-L1/PD-1单抗联用组小鼠肿瘤体积相较于单独用药组明显缩小（p＜0.05）,IHC和IOD示瘤体内F4/80、FAPα表达明显下降（p＜0.05）,颗粒酶B含量显著上升（p＜0.05）。在EL4小鼠皮下荷瘤模型中,以PT100和PD-L1单抗联用组效果最佳,在Hep1-6小鼠皮下荷瘤模型中,则以PT100和PD-1单抗联用组效果最佳,而在4T1小鼠乳腺癌转移模型中,联合用药组小鼠瘤体虽小于对照组（p＜0.05）,但和PT100单药组无显著差异。IHC染色提示4T1皮下瘤原位处FAPα表达较低,但是肿瘤肺转移灶处FAPα表达水平较高。11.不同疾病阶段MM患者中FAPα+巨噬细胞和各T细胞亚群分布情况。FCM检测示R-ISS III期初发患者及复发MM患者骨髓样本中CD138+MM细胞和FAPα+PD-L1+巨噬细胞相较于健康供者骨髓样本显著增高（p＜0.05）,并且两者呈正相关关系（p＜0.05）。对比健康供者,在MGUS和R-ISS I期阶段初发患者Th1和Tc1比例分别在CD4+T和CD8+T细胞中下降（p＜0.05）,R-ISS II/III期比例上升而与健康供者无显著差异（p＞0.05）。颗粒酶B+在CD4+T和CD8+T细胞中比例在完全缓解患者中上升（p＜0.05）。12.不同疾病阶段MM患者上清中细胞因子水平差异。对比健康供者骨髓上清,TGFβ1在R-ISS III期初发患者中显著升高（p＜0.05）,而MCSF在复发MM患者中显著升高（p＜0.05）,可溶性FAPα在R-ISS I/III期初发患者中显著升高（p＜0.05）。可溶性PD-L1在R-ISS I期初发患者中显著升高（p＜0.05）,IFNγ在R-ISS III期初发患者中升高（p＜0.05）,而颗粒酶B水平在初发、复发及治疗组患者中均和健康对照无显著差异（p＞0.05）。其中在初发患者中,TGFβ1和MCSF水平和FAPα呈正相关（p＜0.05）,而可溶性PD-L1和IFNγ水平呈负相关（p＜0.05）。13.同一患者在初发和复发时不同指标表达水平。IHC和IOD示患者复发时相较于其初发状态,其CD138、CD68、CD4表达水平均有显著增高（p＜0.05）,其余指标无显著差异,提示患者复发时巨噬细胞含量增多,CD4+T细胞有浸润但不能抑制肿瘤细胞。IHC和IOD示在患者初发时,CD138表达和FAPα表达呈正相关,初发时高表达FAPα患者其PFS和OS相较于低表达组均下降（p＜0.05）。结论1.MM细胞可通过分泌TGFβ1和MCSF诱导巨噬细胞表达FAPα。2.巨噬细胞上FAPα可促进其PD-L1表达以诱导T细胞凋亡。3.巨噬细胞上FAPα表达可诱导T细胞的衰老,包括CD28表达下降和颗粒酶B分泌减少,并与其酶活性相关。4.FAPα抑制剂PT100可与PD-L1/PD-1单抗联用促进T细胞对MM细胞的杀伤。5.去除巨噬细胞可促进PD-1单抗对MM荷瘤小鼠的治疗效果,而PD-L1单抗本身即可减少瘤体巨噬细胞。6.FAPα抑制剂PT100可与PD-L1/PD-1单抗联用提高对PD-L1/PD-1单抗耐药的肿瘤的治疗效果。7.MM患者中早期（MGUS和R-ISS I期）其Th1和Tc1抗肿瘤免疫下降,而R-ISS II/III期其不足以抑制肿瘤发展,同时MM患者中颗粒酶B分泌不足。该肿瘤免疫微环境形成可能与MM细胞诱导巨噬细胞表达FAPα相关。并且初发骨髓瘤患者中,其FAPα表达越高,可能提示预后越差。