论文部分内容阅读
蛋白质相互作用对生物体内几乎每一个进程都非常重要，虽然已经开发出很多能够检测蛋白质相互作用的方法，然而能有效检测蛋白质实时动态相互作用的方法却非常有限。生物发光共振能量转移(BRET)技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术，它能够检测生物活体内蛋白质相互作用并具有检测体内实时动态相互作用的巨大潜力，但是应用到原核生物体内的BRET技术迄今未见报道。本研究构建了一种基于细菌荧光素酶LuxAB的BRET系统，通过对BRET系统荧光受体蛋白的筛选，发现LuxAB的发射光不能有效激发绿色荧光蛋白和橙色荧光蛋白，但是能有效激发增强型黄色荧光蛋白eYFP，该荧光蛋白能够接受细菌荧光素酶LuxAB发射的蓝色光，并激发出黄色的荧光，产生明显的能量转移信号。随后通过将LuxAB、eYFP分别与调控细菌鞭毛合成的相互作用蛋白FlgM、FliA融合表达，结果检测到两个蛋白互作的BRET信号，说明该系统能够用于蛋白质相互作用的检测。进一步我们利用该系统检测了雷帕霉素诱导的小鼠蛋白FRB和FKBP12的互作，以及FKBP12的配体FK506对FRB和FKBP12相互作用的剂量依赖性动态竞争抑制作用，并利用该技术得到了FK506动态竞争抑制两蛋白互作的竞争性抑制常数IC50值，表明此基于LuxAB的BRET系统能够检测细菌胞内的动态蛋白质相互作用。利用该系统还观察到渗透压调控蛋白OmpR在高渗透压或低pH诱导下产生同源二聚化信号的动态过程，其中由酸诱导发生的二聚化现象经碱中和后二聚化信号动态消失。以上结果表明该BRET系统不仅能够检测细菌体内蛋白质动态的相互作用，而且可以应用于蛋白质相互作用动力学分析研究，可应用于生物发育和细菌的致病性等方面的重要蛋白质-蛋白质相互作用的实时动态检测。总之本研究构建的基于细菌荧光素酶LuxAB的BRET系统第一次实现了能够在原核活体细胞内实时动态检测蛋白质相互作用，为以后蛋白质动态相互作用的研究奠定了坚实的基础。