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A型流感病毒是一种囊膜病毒,其复制过程需要经过出芽步骤才能将完整的子代病毒粒子从宿主细胞中释放。目前的研究表明病毒蛋白中的M2是与出芽功能密切相关的,最新研究发现M2蛋白在流感病毒感染宿主细胞的过程中,会特异性的招募宿主细胞中的一种自噬相关的蛋白LC3,并将其定位至细胞膜表面。M2蛋白的胞内区域存在与LC3蛋白互作区域(LC3Interaction Region,LIR),将该区域进行突变消除两者之间的相互作用后所得到突变型病毒的形态与稳定性都会受到影响,然而分子机制尚不清楚,M2蛋白的LIR区域与LC3蛋白在流感病毒出芽过程中如何影响子代病毒的形态与稳定性也不清楚。为了揭示LC3蛋白在流感病毒复制、子代病毒形态与稳定性的作用,本研究利用CRISPRCas9技术构建了LC3蛋白敲除的A549细胞系(A549-LC3KO),通过对流感病毒在A549与A549-LC3KO的复制、产生病毒粒子的形态以及对胰酶耐受能力等进行比较,结果显示,流感病毒在A549-LC3KO细胞上的复制速率慢于A549,说明LC3蛋白对流感病毒的复制发挥作用。对在两种细胞上繁殖的病毒粒子形态与胰酶耐受性进行检测,结果显示在A549细胞中繁殖的病毒形态呈圆形均一,大小较为一致,囊膜完整,而在A549-LC3KO中复制的病毒粒子形态不均一,大小也存在较大差异。但两种病毒对胰酶处理的耐受性较为接近,没有明显差别。此结果说明LC3蛋白对流感病毒的复制、形态与大小存在一定影响,但对病毒的稳定性,也就是外源胰酶耐受能力没有影响。M2蛋白与LC3蛋白互作的LIR结构域是一个疏水结构域,为了进一步研究M2蛋白的LIR区域本身对病毒复制、形态以及稳定性的影响,分别将M2蛋白的LIR区域的氨基酸(FVI)突变为亲水性氨基酸SSS或者疏水性氨基酸AAA,利用反向遗传技术,拯救出两种突变病毒M2-FVI/AAA与M2-FVI/SSS,并对其生长特性、胰酶耐受力、病毒形态、致病性进行评估。结果显示与野生病毒比较,两种突变病毒和野毒在MDCK细胞上的复制能力类似。胰酶耐受实验结果显示M2-FVI/AAA与野毒株对胰酶处理具有耐受性,M2-FVI/SSS对胰酶处理较为敏感,内部蛋白会被胰酶消化降解,暗示此病毒的囊膜结构可能不完整。进一步对病毒粒子进行电镜观察显示M2-FVI/SSS病毒的囊膜存在缺损,这是此病毒对胰酶处理不耐受的原因,这也会导致病毒稳定性下降。致病性实验结果也显示M2-FVI/SSS对小鼠的致病性明显降低,在小鼠肺脏中的复制能力也显著下降,说明流感病毒M2蛋白的LIR区域亲疏水性对于流感病毒粒子的外膜完整性、致病性非常重要。本文对于A型流感病毒LC3蛋白与M2蛋白的LIR结构域对流感病毒生物学特性影响进行研究,发现M2蛋白的LIR区域的亲疏水性会对流感病毒的囊膜完整性以及致病性发挥重要作用。