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禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus，REVs)是一种C型禽逆转录病毒，该病毒能引起各种感染宿主的免疫抑制、矮小综合征及淋巴瘤等，且该病毒对新的宿主具有潜在威胁，增加了家禽养殖业的压力与风险。由该病毒引起的免疫抑制，能够引起宿主的二次感染或/和混合感染，加重病程，造成严重经济损失。目前，REV在世界各地广泛传播，且与其他免疫抑制病毒的共感染情况广泛存在，给家禽养殖业带来严重损失，同时在一定程度上对人类的健康也具有潜在威胁，因此，研究该疾病也有公共卫生学上的实际意义。
本研究以SPF鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts，CEF)为对象，在成功建立REV感染细胞模型的基础上，应用二代测序技术对REV感染的CEF微小RNA(microRNA，miRNA)及其转录组进行测序，并建库，经GO及KEGG富集分析，随即应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)对功能性miRNA及功能性基因进行鉴定，剔除未鉴定出的差异miRNA及基因，再进行功能分析。进而对REV感染过程中CEF表型进行测定，以期鉴定功能性miRNA及信号通路调控与细胞表型变化是否一致。该项研究旨在探索REV感染CEF后，其功能性miRNA及功能性信号通路的变化，为进一步阐明REV的致病机制及其引起宿主反应的机制提供基础实验依据。主要研究结果如下：
1.首先制作SPF鸡胚成纤维细胞，待其生长到80%后，感染REV。之后通过PCR方法对病毒的感染进行鉴定，结果在REV感染的SPFCEF中检测到REV的特异性LTR保守序列，而在未感染REV的对照细胞中未扩增出该基因。表明，REV感染SPFCEF模型建立成功。
2.对miRNA的靶基因进行GO及KEGG富集分析发现，细胞代谢相关通路是所有靶基因中最为富集的生物学通路，REV能够促进SPFCEF的代谢。应用透射电镜技术观察发现，REV感染细胞，其胞浆中的糖原含量显著高于对照细胞，从超微形态变化角度证明REV能够提升细胞的代谢水平，其改变与miRNA靶基因结果一致。葡萄糖转运体(glucose transporter，GLUTs)在葡萄糖转运过程中发挥核心作用，本研究发现，REV感染SPFCEF的GLTUs各个亚型的表达水平显著高于对照细胞，表明GLUTs在REV调控的代谢水平升高中发挥重要作用。通过分析还发现，GLUTs并不是miRNA的靶基因，REV激活了GLUTs的表达，将大量葡萄糖转运至细胞质内，从而激活miRNA功能，提升了细胞的代谢水平。
3.在鉴定出的41个差异表达miRNA中，有20个差异miRNA与SPFCEF的细胞周期调控相关，表明miRNA在REV感染SPFCEF中，对细胞周期调控有重要作用。GO与KEGG富集分析发现，miRNA的靶基因极显著富集在细胞周期通路上。应用流式细胞技术对细胞周期分析发现，REV感染的SPFCEF中，39.69%细胞处于S期，而处于S期的对照细胞只有13.71%，表明REV能够促进SPFCEF从G1期向S期转化。KEGG对细胞周期分析表明，CyclinD1/CDK6复合物在REV调控细胞周期从G1期到S期转化中起核心作用。对相关基因分析发现，MDM2能够磷酸化p53，进而抑制该信号通路对CyclinD1/CDK6复合物的抑制作用；而REV也能抑制周期素依赖激酶抑制因子，促进CyclinD1/CDK6复合物的表达。上述结果表明，REV通过miRNA对CyclinD1/CDK6复合物的调控，而促进REV感染SPFCEF从G1期向S期转化。
4.对差异miRNA靶基因进行富集分析发现，凋亡是其中一条富集通路。应用荧光显微镜检测显示，REV感染的SPFCEF中，其细胞凋亡信号弱于对照细胞。表明REV感染能够抑制SPFCEF凋亡。对凋亡相关基因分析表明，cIAP1和CFLAR在REV感染细胞中的表达高于对照细胞，而Casp-6、BID和ENDOG在REV感染细胞中的表达则受到抑制。其中，BID和ENDOG作为凋亡促进因子能够引起细胞凋亡的激活，cIAP1和CFLAR则抑制caspases活化进而对细胞凋亡发挥负调控作用。上述结果表明，REV通过调控miRNA促进促凋亡因子的表达，抑制凋亡抑制因子的活化，抑制细胞凋亡。
5.本研究鉴定出一个新的miRNA，即novel-72。novel-72在REV感染的SPFCEF中的表达显著低于未感染REV的对照细胞；KEGG富集分析表明，该miRNA的靶基因极显著富集于mTOR信号通路上。PDPK1为novel-72的靶基因，该因子能磷酸化、并激活蛋白激酶B(AKT)，而AKT通过磷酸化抑制转化生长因子(TSC)和脯氨酸富集蛋白(PRAS40)，激活mTOR。表明novel-72可能通过靶向调节PDPK1，启动对mTOR信号通路的调控进而控制下游靶向基因的表达。S6K1和eIF4E在REV感染的SPFCEF中表达高于对照细胞，而S6K1和eIF4E协同作用能够促进细胞从G1期向S期转化。因此，REV在感染过程中，通过调节Novel-72，进而影响mTOR信号通路对细胞周期及细胞生长的调控。
6.对转录组基因进行KEGG富集分析发现，Wnt信号通路在REV感染SPFCEF过程中发挥着重要作用。Wnt8B、Wnt16、Wnt10A、Wnt9A、Wnt3A、Wnt6及Wnt5B在REV感染的SPFCEF中表达明显高于对照细胞，表明REV能够激活Wnt信号通路。检测还发现，TCF7L1、TCF7L2、LEF1及β-catenin表达量在REV感染的SPFCEF中显著高于对照细胞。TCF7L1、TCF7L2、LEF1为T细胞因子家族成员，能够在细胞核内招募β-catenin靶向与增强子结合，促进下游因子转录的增强。本研究检测到Wnt信号通路下游因子C-mcy、c-jun及MMP在REV感染细胞中高表达，表明该信号通路在调控细胞增殖及细胞迁移方面起到重要作用。
7.MAPK信号通路在细胞增殖及生长方面起重要作用。研究发现，TrkA在REV感染细胞中表达显著高于对照细胞。TrkA是一种膜结合受体，其功能与细胞分化及病毒复制周期有密切相关性。REV可能通过介导TrkA的高表达，促进自身在CEF中的复制。Ras、Raf1、c-fos和c-jun在REV感染的SPFCEF中表达显著高于对照细胞，而这些因子都是MAPK信号通路的下游靶向转录因子。其中Ras和Raf1为原癌基因，表明MAPK信号通路可能与REV诱导的肿瘤形成有关。C-fos能够与c-jun形成异源二聚体，进而调控细胞周期素D1(CyclinD细胞周期素A(CyclinA)和细胞周期素E(CyclinE)的过表达。因此，MAPK信号通路在细胞周期调控中也发挥一定作用。KEGG信号通路分析表明，Ca2+能够激活Ras，进而调控MAPK信号通路。故可能是钙离子信号通路与MAPK信号通路共同作用完成REV感染对SPFCEF周期的调控。
本研究以SPF鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts，CEF)为对象，在成功建立REV感染细胞模型的基础上，应用二代测序技术对REV感染的CEF微小RNA(microRNA，miRNA)及其转录组进行测序，并建库，经GO及KEGG富集分析，随即应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)对功能性miRNA及功能性基因进行鉴定，剔除未鉴定出的差异miRNA及基因，再进行功能分析。进而对REV感染过程中CEF表型进行测定，以期鉴定功能性miRNA及信号通路调控与细胞表型变化是否一致。该项研究旨在探索REV感染CEF后，其功能性miRNA及功能性信号通路的变化，为进一步阐明REV的致病机制及其引起宿主反应的机制提供基础实验依据。主要研究结果如下：
1.首先制作SPF鸡胚成纤维细胞，待其生长到80%后，感染REV。之后通过PCR方法对病毒的感染进行鉴定，结果在REV感染的SPFCEF中检测到REV的特异性LTR保守序列，而在未感染REV的对照细胞中未扩增出该基因。表明，REV感染SPFCEF模型建立成功。
2.对miRNA的靶基因进行GO及KEGG富集分析发现，细胞代谢相关通路是所有靶基因中最为富集的生物学通路，REV能够促进SPFCEF的代谢。应用透射电镜技术观察发现，REV感染细胞，其胞浆中的糖原含量显著高于对照细胞，从超微形态变化角度证明REV能够提升细胞的代谢水平，其改变与miRNA靶基因结果一致。葡萄糖转运体(glucose transporter，GLUTs)在葡萄糖转运过程中发挥核心作用，本研究发现，REV感染SPFCEF的GLTUs各个亚型的表达水平显著高于对照细胞，表明GLUTs在REV调控的代谢水平升高中发挥重要作用。通过分析还发现，GLUTs并不是miRNA的靶基因，REV激活了GLUTs的表达，将大量葡萄糖转运至细胞质内，从而激活miRNA功能，提升了细胞的代谢水平。
3.在鉴定出的41个差异表达miRNA中，有20个差异miRNA与SPFCEF的细胞周期调控相关，表明miRNA在REV感染SPFCEF中，对细胞周期调控有重要作用。GO与KEGG富集分析发现，miRNA的靶基因极显著富集在细胞周期通路上。应用流式细胞技术对细胞周期分析发现，REV感染的SPFCEF中，39.69%细胞处于S期，而处于S期的对照细胞只有13.71%，表明REV能够促进SPFCEF从G1期向S期转化。KEGG对细胞周期分析表明，CyclinD1/CDK6复合物在REV调控细胞周期从G1期到S期转化中起核心作用。对相关基因分析发现，MDM2能够磷酸化p53，进而抑制该信号通路对CyclinD1/CDK6复合物的抑制作用；而REV也能抑制周期素依赖激酶抑制因子，促进CyclinD1/CDK6复合物的表达。上述结果表明，REV通过miRNA对CyclinD1/CDK6复合物的调控，而促进REV感染SPFCEF从G1期向S期转化。
4.对差异miRNA靶基因进行富集分析发现，凋亡是其中一条富集通路。应用荧光显微镜检测显示，REV感染的SPFCEF中，其细胞凋亡信号弱于对照细胞。表明REV感染能够抑制SPFCEF凋亡。对凋亡相关基因分析表明，cIAP1和CFLAR在REV感染细胞中的表达高于对照细胞，而Casp-6、BID和ENDOG在REV感染细胞中的表达则受到抑制。其中，BID和ENDOG作为凋亡促进因子能够引起细胞凋亡的激活，cIAP1和CFLAR则抑制caspases活化进而对细胞凋亡发挥负调控作用。上述结果表明，REV通过调控miRNA促进促凋亡因子的表达，抑制凋亡抑制因子的活化，抑制细胞凋亡。
5.本研究鉴定出一个新的miRNA，即novel-72。novel-72在REV感染的SPFCEF中的表达显著低于未感染REV的对照细胞；KEGG富集分析表明，该miRNA的靶基因极显著富集于mTOR信号通路上。PDPK1为novel-72的靶基因，该因子能磷酸化、并激活蛋白激酶B(AKT)，而AKT通过磷酸化抑制转化生长因子(TSC)和脯氨酸富集蛋白(PRAS40)，激活mTOR。表明novel-72可能通过靶向调节PDPK1，启动对mTOR信号通路的调控进而控制下游靶向基因的表达。S6K1和eIF4E在REV感染的SPFCEF中表达高于对照细胞，而S6K1和eIF4E协同作用能够促进细胞从G1期向S期转化。因此，REV在感染过程中，通过调节Novel-72，进而影响mTOR信号通路对细胞周期及细胞生长的调控。
6.对转录组基因进行KEGG富集分析发现，Wnt信号通路在REV感染SPFCEF过程中发挥着重要作用。Wnt8B、Wnt16、Wnt10A、Wnt9A、Wnt3A、Wnt6及Wnt5B在REV感染的SPFCEF中表达明显高于对照细胞，表明REV能够激活Wnt信号通路。检测还发现，TCF7L1、TCF7L2、LEF1及β-catenin表达量在REV感染的SPFCEF中显著高于对照细胞。TCF7L1、TCF7L2、LEF1为T细胞因子家族成员，能够在细胞核内招募β-catenin靶向与增强子结合，促进下游因子转录的增强。本研究检测到Wnt信号通路下游因子C-mcy、c-jun及MMP在REV感染细胞中高表达，表明该信号通路在调控细胞增殖及细胞迁移方面起到重要作用。
7.MAPK信号通路在细胞增殖及生长方面起重要作用。研究发现，TrkA在REV感染细胞中表达显著高于对照细胞。TrkA是一种膜结合受体，其功能与细胞分化及病毒复制周期有密切相关性。REV可能通过介导TrkA的高表达，促进自身在CEF中的复制。Ras、Raf1、c-fos和c-jun在REV感染的SPFCEF中表达显著高于对照细胞，而这些因子都是MAPK信号通路的下游靶向转录因子。其中Ras和Raf1为原癌基因，表明MAPK信号通路可能与REV诱导的肿瘤形成有关。C-fos能够与c-jun形成异源二聚体，进而调控细胞周期素D1(CyclinD细胞周期素A(CyclinA)和细胞周期素E(CyclinE)的过表达。因此，MAPK信号通路在细胞周期调控中也发挥一定作用。KEGG信号通路分析表明，Ca2+能够激活Ras，进而调控MAPK信号通路。故可能是钙离子信号通路与MAPK信号通路共同作用完成REV感染对SPFCEF周期的调控。