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几丁质作为其表皮的主要成分,对昆虫的生存至关重要。昆虫体内的几丁质需要不断被合成和降解以满足其生长发育的需要。几丁质酶是几丁质降解过程中的关键酶之一。昆虫几丁质酶分属10个家族,其中Ⅲ家族几丁质酶经预测为膜结合蛋白,并且具有独特的结构域组成,含有两个催化域和一个几丁质结合域。由于该酶的生理重要性已被RNA干扰实验所证实,因此有可能成为绿色农药靶标。然而,该酶在家蚕的蜕皮液中没有发现,其具体生理功能还是未知。本论文以重要农业害虫—亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶OfChtⅢ为研究对象,开展克隆表达及酶学性质研究,为阐明其生理功能提供了思路。本论文包括以下研究内容：(1)通过PCR及RACE克隆了亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶OfChtⅢ基因,分析其cDNA序列,OfChtⅢ全长4193-bp,其中编码区编码987个氨基酸,N端含有一个长度为23 AA的跨膜区域。OfChtⅢ含有两个催化域(CAD),一个几丁质结合域(CBD),进化分析OfChtⅢ属于Ⅲ家族昆虫几丁质酶分支。(2)在毕赤酵母GS115中成功重组表达亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶的两个催化域OfChtⅢ-1.OfChtⅢ-2/OfChtⅢ-△2,通过硫酸铵沉淀、金属螯合层析分离纯化OfChtⅢ-2和OfChtⅢ-△2,利用阳离子交换层析分离纯化OfChtⅢ-1。质谱分析证明OfChtⅢ的断裂发生在Arg503和Lys510,导致丢失一段序列为"VKKPTKK"的肽段。(3)酶学性质表征。OfChtⅢ-1.OfChtⅢ-△2和OfChtⅢ-2具有相同的最适pH值6.0。OfChtⅢ-1对4MU-β-(G1cNAc)2底物的亲和力高于OfChtⅢ-Δ2,但催化效率低于OfChtⅢ-△2;OfChtⅢ-1对4MU-β-(GlcNAc)3和乙二醇几丁质的亲和力低于OfChtⅢ-△2,但与OfChtⅢ-△2的催化效率相近。OfChtⅢ-1及OfChtⅢ-△2对于寡糖底物(GlcNAc)n(n=2-6)的催化活性随着聚合度降低而降低,两个催化域都不能水解(G1cNAc)3. OfChtⅢ-1与OfChtⅢ-△2对乙二醇几丁质的水解效率要远远高于胶体几丁质和a-几丁质。OfChtⅢ-1与OfChtⅢ-△2和OfChtⅢ-2对于三种高聚底物的水解都没有体现出协同作用。(4)OfChtⅢ断裂时期分析及全长蛋白获取。Western blot证明OfChtⅢ的断裂发生在酵母细胞内。推测可能是由于毕赤酵母的分泌表达途径中的蛋白酶将OfChtⅢ水解。分别通过向培养基中加入蛋白酶抑制剂、酪蛋白水解物改造培养基;将目的基因构建到蛋白酶缺陷型毕赤酵母菌株SMD1168以及将OfChtⅢ的linker部位的Lys和Arg突变成Asn尝试全长蛋白表达,但是这三种方法都没能成功获得全长蛋白。(5)成功构建并表达全长蛋白OfChtⅢ-DGY。将目的基因构建到胞内表达载体pPIC3.5k中,利用金属螯合层析进行分离纯化,纯度较低,利用4MU-β-(GlcNAc)2测定各组分的比活力,发现目的蛋白可能被150 mM咪唑洗脱下来。利用凝胶筛分进一步纯化,得到分子量约为92.4 kDa的蛋白,并对其进行Western blot及Native PAGE和底物胶电泳验证,结果证明获得的蛋白是OfChtⅢ-DGY,但是蛋白的表达量很低,表达条件需要进一步摸索及优化。