研究背景:胃癌(Gastric Cancer)由于其高患病率成为世界第二大引起患者死亡的肿瘤。它的发生及发展包含很多功能基因的参与,与表观遗传学调控密切相关。包含DNA甲基化在内的表观遗传学修饰是指在基因的碱基序列不发生变化的情况下,生物体内部分基因表达水平产生了变化进而影响生命活动的过程。DNA甲基化在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用,抑癌基因启动子区的高度甲基化会使抑癌基因失活。DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供所需的甲基,在甲基转移酶DNMTs的催化下,将Cp G二核苷酸中C甲基化成为5-甲基胞嘧啶(5m C),Cp G的高度甲基化会使许多肿瘤相关基因转录活性受到抑制。C的甲基化修饰是一个动态可逆的过程,5m C可以经历去甲基化。DNA去甲基化有主动去甲基化和被动去甲基化。被动去甲基化指的是由于DNMTs的活性受到抑制,使得DNA双链的甲基化状态减弱的现象。主动去甲基化则是由TET蛋白家族介导的生物过程,TET(Ten eleven translocation)蛋白家族可以在α-酮戊二酸和Fe2+的辅助下将5m C氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hm C),并继续将5hm C催化为5-甲酰胞嘧啶(5-f C)和5-羧基胞嘧啶(5ca C),5f C和5ca C在胸腺嘧啶糖苷酶TDG及碱基切除修复(BER)通路的作用下被修饰成为未甲基化的C。TET蛋白家族这一催化功能不仅参与调控哺乳动物的生长发育过程,而且在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。前期研究中,我们使用5-aza-d C处理胃肿瘤细胞系。发现,胃癌细胞内部分高度甲基化低表达的抑癌基因如RASSF1A基因上调。这说明5-aza-d C抑制了DNMTs蛋白家族的催化作用,使高度甲基化基因的甲基化程度减弱,得以增加表达量。值得注意的是我们同时发现TET蛋白家族含量也发生了变化,经过5-aza-d C处理后的胃癌细胞内TET1基因的表达增强。我们推测,作为DNA甲基转移酶抑制剂,5-aza-d C在抑制DNMTs蛋白介导被动去甲基化作用的同时有可能也诱导了主动去甲基化的发生。目的:1)探讨胃癌组织和癌旁相对正常组织中TET1和TET2基因,5m C和5hm C的表达情况,是否存在差异;2)观察去甲基化剂5-aza-d C处理前后MGC803细胞内各代表因子的表达情况,探讨5-aza-d C对胃癌细胞主动去甲基化过程的影响。方法:1)对于胃癌和癌旁相对正常冰冻组织样本,采用RT-q PCR和IHC检测胃癌和癌旁相对正常组织内TET1和TET2基因,5m C和5hm C的表达情况。2)采用RT-PCR、RT-q PCR和ICC检测5-aza-d C处理前后细胞内DNMTs、TETs、TIMP3和RASSF1A基因,5m C和5hm C的表达情况。结果:1)TET1基因在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁相对正常组织,且p<0.05;而在胃癌组织与癌旁相对正常组织中TET2基因的表达水平差异并没有统计学意义。2)5m C在胃癌组织中的含量明显高于癌旁相对正常组织,且p<0.05;5hm C在胃癌组织中的含量明显低于癌旁相对正常组织,且p<0.05;5m C和5hm C之间呈负相关,且相关具有统计学意义(p<0.05)。3)使用去甲基化剂5-aza-d C作用MGC803细胞后,细胞内DNMTs基因的转录水平逐渐降低;TET1基因的表达从第二天开始明显增强,并在第3天达到峰值,第4、5天保持稳定,且变化具有统计学意义(p<0.05);TET2基因的表达前后差异不明显;TIMP3和RASSF1A基因的表达随着药物作用时间的增长而逐渐升高。4)使用去甲基化剂5-aza-d C处理MGC803后,5m C的含量随着药物作用时间的增长而降低;5hm C的含量在TET1蛋白水平升高进入细胞核作用后升高。结论:1)在胃癌的发生发展过程中,TET1基因由于表达活性下降,导致TET1蛋白介导的主动去甲基化过程受到抑制,这可能是胃癌细胞基因组甲基化特征形成的一个重要原因。2)胃癌基因组内两种不同类型胞嘧啶的比例(5m C/5hm C)明显高于癌前组和癌旁相对正常组,表明5m C和5hm C的动态变化可能与胃癌的发生发展紧密相关。3)我们推测5-aza-d C不仅可以通过抑制DNMTs蛋白的甲基化酶活性介导被动去甲基化,还可以通过增强TET1基因的表达进而参与参与主动去甲基化。在两种去甲基化机制的共同作用下,改变胃癌细胞基因组的甲基化特征,使某些由于过甲基化沉默的抑癌基因重新获得表达。4)TET1、5m C和5hm C的检测分析可以作为胃癌早期诊断的手段,也可以作为临床肿瘤治疗和预后判断的重要生物学指标。