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背景和目的旋毛虫病主要是由于生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫（muscle larvae,ML）囊包的动物肉类引起的,幼虫在宿主的胃内经消化液作用脱囊,然后被胆汁激活为肠道感染性幼虫（intestinal infective larvae,IIL）,IIL幼虫侵入小肠上皮细胞（intestinal epithelium cells,IECs）,在肠道内经过4次蜕皮发育为成虫（adult worms,AW）。雌雄虫交配后产生新生幼虫（newborn larvae,NBL）,随着静脉或淋巴管至宿主全身,侵入骨骼肌的幼虫发育为成囊期肌幼虫,在宿主体内长时间存在。旋毛虫侵入IECs的过程是旋毛虫感染宿主的关键阶段,幼虫只有成功侵入IECs才能发育为成虫,因此,在旋毛虫侵入过程中发挥作用的蛋白酶可能是抗旋毛虫病疫苗与药物新的靶点。半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的生长发育、侵袭以及免疫逃避中发挥了重要的作用。因此,本文从旋毛虫基因库中选择肠道特异性半胱氨酸蛋白酶（Gut-specific cysteine proteinase,TsGSCP,Gen Bank:XM＿003377192.1）作为研究对象,通过克隆表达、免疫荧光抗体试验（IFA）、免疫组化、Western blot、ELISA和RNAi等实验技术,观察了TsGSCP的生物学特性及其在旋毛虫幼虫侵入IECs中的作用。材料与方法1.实验动物,旋毛虫虫种,细胞系和菌种从河南省实验动物中心购买4周龄雌性SPF级KM小鼠。本实验所用旋毛虫为河南省南阳猪源旋毛虫T1（国际标准虫种标号为ISS534）,细胞是从正常小鼠小肠分离的IECs,所用菌种为E.coli BL21。2.TsGSCP的生物信息学分析从NCBI获得TsGSCP的mRNA序列,通过生物信息学分析软件对TsGSCP的理化性质进行分析;应用Bio Edit和MEGA软件对TsGSCP进行多序列比对与进化树分析。3.rTsGSCP的表达纯化及抗原性分析构建重组表达质粒pMAL-c2x/TsGSCP,导入BL21宿主菌内,经1 m M IPTG在25℃条件下诱导6 h后,纯化获得带有MBP标签的融合蛋白rTsGSCP,免疫小鼠制备抗rTsGSCP血清。收集旋毛虫IIL幼虫制备虫体可溶性抗原与ES抗原,通过Western blot检测rTsGSCP的抗原性。4.TsGSCP在不同虫期的表达与定位制备旋毛虫不同虫期（ML、IIL、AW及NBL）的cDNA进行qPCR,检测TsGSCP在不同虫期的转录情况;制备不同虫期的可溶性抗原,通过Western blot、IFA以及免疫组化试验,观察TsGSCP在不同虫期的表达及其在虫体组织的定位。5.Far-western、IFA检测rTsGSCP与IECs及肠黏膜的结合制备IECs可溶性蛋白,通过Far-western和Far-ELISA检测rTsGSCP与IECs蛋白的结合;通过IFA观察rTsGSCP与IECs的结合及其定位;制备正常小鼠小肠黏膜切片,通过IFA观察rTsGSCP与肠黏膜组织的特异性结合。6.rTsGSCP对旋毛虫侵入IECs与肠黏膜的促进作用将IL1幼虫与单层IECs共孵育2 h后,观察rTsGSCP与抗rTsGSCP血清对幼虫侵入IECs的影响;此外,将经抗rTsGSCP血清孵育后的肌幼虫经口感染小鼠,感染后5 d观察成虫虫荷、形态以及雌虫的生殖力。7.RNA干扰TsGSCP基因对旋毛虫侵入功能以及对生长发育和生殖力的影响设计含有T7启动子的TsGSCP引物,在体外反转得到干扰TsGSCP基因的dsRNA,通过电穿孔法将dsRNA导入旋毛虫肌幼虫中,应用Real-time PCR、Western blot分析dsRNA-TsGSCP干扰的最适浓度、时间,以及TsGSCP转录与表达水平;此外,本文还应用特异性底物测定了干扰前后旋毛虫虫体可溶蛋白中天然半胱氨酸蛋白酶的酶活性改变;观察TsGSCP基因沉默对对幼虫侵入IECs及肠粘膜的抑制作用;最后观察了RNA干扰TsGSCP基因对旋毛虫生长发育和生殖力的影响。8.统计学处理通过SPSS和Graphpad软件处理实验数据,根据数据的类型选择合适的统计学分析方法。本次研究运用的统计学方法有方差分析和卡方检验,检验水平为α=0.05。结果1.TsGSCP的生物信息学分析应用生物信息学软件对TsGSCP（Gen Bank:XM＿003377192.1）的理化性质进行分析,结果显示TsGSCP基因序列编码325个氨基酸,等电点为6.88,具有信号肽;TsGSCP的二级结构有8个α螺旋,7个β折叠;TsGSCP三级结构预测有4个酶活性位点,分别为组氨酸（His）、谷氨酰胺（Gln）、半胱氨酸（Cys）及天冬酰胺（Asn）。该蛋白酶家族具有C1肽酶家族（组织蛋白酶B家族）的功能域。2.rTsGSCP的抗原性分析SDS-PAGE结果显示,rTsGSCP分子量为74.2 kDa（cDNA克隆34.2 k Da+MBP-tag40 k Da）;Western blot结果表明,rTsGSCP能被旋毛虫感染小鼠血清和抗rTsGSCP免疫血清识别,但并不能被正常小鼠血清识别,表明rTsGSCP具有良好的抗原性。抗rTsGSCP血清能识别IIL虫体粗蛋白中天然的TsGSCP,但不能识别IIL ES抗原中的TsGSCP,提示TsGSCP是一种虫体蛋白而不是分泌蛋白。3.TsGSCP在不同虫期的表达及定位Western blot发现,旋毛虫各个虫期的可溶性蛋白中均有TsGSCP的表达,且TsGSCP在肠道感染期幼虫期的表达量明显高于其他虫期（P<0.05）;IFA和免疫组化结果显示,TsGSCP在旋毛虫的不同虫期（ML、IIL、AW及NBL）都有表达,主要定位于旋毛虫的表皮及雌虫胚胎。4.rTsGSCP与IECs及肠黏膜的特异性结合Far-Western结果显示,IECs蛋白与rTsGSCP孵育后能被抗rTsGSCP血清识别出7个条带（96.2、70.8、63.6、56.4、47.4、38.8及36.4 k Da）,被感染血清识别出6个条带（97.2、75.0、62.7、57.9、46.4及41.9 k Da）。ELISA结果表明,OD值随IECs蛋白浓度增加而升高（F=397.007,P<0.05）,与IECs蛋白剂量具有相关性（r=0.994,P<0.05）;OD值随rTsGSCP蛋白浓度升高而增加,与rTsGSCP蛋白剂量呈相关性（F=99.967,P<0.05;r=0.976,P<0.05）;IFA结果显示rTsGSCP能与小肠黏膜特异性结合,但不能与小鼠的肝脏和肺脏组织结合;rTsGSCP只能与IECs结合而不能与C2C12结合,rTsGSCP与IECs的结合部位是在细胞质。5.rTsGSCP对旋毛虫幼虫体外侵入IECs与肠黏膜的促进作用将IL1幼虫与rTsGSCP（或IIL ES和MBP标签蛋白）、抗rTsGSCP血清（或感染血清,正常血清、标签血清）与IECs单层细胞共孵育2 h后,观察幼虫对细胞单层的侵入。结果显示,当TsGSCP浓度为9、12、15μg/m L时,IL1幼虫的侵入率分别为80.95%、84.49%和86.74%,与PBS对照组相比侵入率增高,差异均有统计学意义（P<0.05）,幼虫侵入率与rTsGSCP剂量具有相关性（r=0.95,P<0.05）,随着rTsGSCP浓度的增高,促进侵入作用增强（F=228.325,P<0.05）。抗rTsGSCP血清对幼虫侵入IECs单层具有明显的抑制作用（χ2=16.743,P<0.05）,当抗rTsGSCP血清稀释度为1:100时对幼虫侵入的抑制率是41.47%,抗rTsGSCP血清的作用与血清稀释度呈剂量依赖性关系（r=-0.969,P<0.05）,随着血清稀释度的增高对旋毛虫侵入的抑制逐渐降低（F=136.542,P<0.05）;将与抗rTsGSCP血清孵育后的ML经口感染小鼠,感染后5 d的肠道成虫减虫率为38.20%,显著高于正常血清与抗MBP-tag标签血清组（F=46.013,P<0.05）,但不同血清组的成虫长度、生殖力及新生幼虫长度之间的差异无统计学意义（P>0.05）,表明抗rTsGSCP血清对旋毛虫侵入肠黏膜具有明显的抑制作用。6.干扰TsGSCP基因抑制了旋毛虫侵入能力以及生长发育和生殖力q PCR与Western blot结果发现,当dsRNA-TsGSCP浓度为20、40和60 ng/μL时,TsGSCP基因的转录与蛋白表达水平量均明显降低（P<0.05）,转录水平分别降低了14.82%、33.30%和62.13%,表达水平分别降低了22.24%、45.28%和60.51%,且dsRNA-TsGSCP处理组的TsGSCP的蛋白表达量随着dsRNA浓度的增高而降低;当TsGSCP基因沉默后幼虫培养2、4、6 d时,TsGSCP基因的转录水平分别降低了24.25%、2.21%及1.89%;TsGSCP蛋白表达量分别降低了46.82%、1.73%、2.26%;在干扰第2天时,dsRNA处理组TsGSCP的表达水平明显降低（χ2=61.438,P<0.05）,表明dsRNA-TsGSCP的最佳干扰时间为2天,且RNA的干扰具有特异性。干扰前后ML和IIL虫体天然可溶蛋白中半胱氨酸蛋白酶的酶活性明分别降低了37.39%和28.00%。TsGSCP基因沉默后对幼虫侵入IECs的抑制率为25.02%,明显高于dsRNA-GFP对照组的3.24%（χ2=5.578,P<0.05）;而且沉默TsGSCP基因后5 d AW减虫率达到35.15%,且雌虫长度明显变短（F=21.082,P?0.05）,产生的新生幼虫数量减少,生殖力降低（F=18.728,P?0.05）。结论1.构建了TsGSCP的重组表达质粒pMAL-c2x/TsGSCP,表达纯化了rTsGSCP。2.TsGSCP在旋毛虫的不同时期（肌幼虫、肠道感染性幼虫、成虫、新生幼虫）均有表达且在肠道感染性幼虫中的表达量最高,主要定位于虫体皮层及雌虫胚胎。3.rTsGSCP能与小鼠肠上皮细胞和小肠黏膜特异性结合而促进了旋毛虫的侵入,而抗rTsGSCP免疫血清能抑制幼虫的侵入。干扰TsGSCP基因可明显降低TsGSCP的表达与酶活性并抑制旋毛虫对肠上皮细胞的侵入,同时影响了旋毛虫的生长发育和生殖力。TsGSCP是旋毛虫的侵入相关蛋白,可作为抗旋毛虫感染疫苗的候选靶分子。