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近年来,HIV感染在全球呈迅猛上升趋势,现已成为世界范围内危害人类健康最严重的传染性疾病。目前针对AIDS的高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retroviral therapy, HAART)主要使用一种HIV-1蛋白酶(Protease, PR)抑制剂(HIV-1 Protease inhibitor, PI)药物结合两种HIV反转录酶抑制剂药物治疗。然而,人类免疫缺陷病毒(HIV) PR对PI类药物的耐药突变已经严重阻碍了抗病毒治疗,因此需要不断开发新的PI类药物用于治疗,同时也对抗HIV药物的体外筛选模型提出了更高的要求。迅速建立新的﹑针对不同序列HIV及耐药突变HIV的体外药物筛选模型抗HIV药物体外筛选模型,使之既与现有的模型相互补充,又能提高抗HIV药物的筛选效率。本研究组应用噬菌体展示技术,构建针对HIV蛋白酶(PR)的适用于PI药物大规模初筛的噬菌体体外筛选模型。获得具有高切割活性HIV蛋白酶是进行噬菌体体外筛选模型切割前提,我们选择了HIV-1 M组B亚型的代表HXB2株PR进行表达、纯化及鉴定,本文将就HIV蛋白酶的表达及活性鉴定进行报告。本研究分为四个部分:1.原核表达、纯化HIV-1 M组B亚型的代表HXB2株蛋白酶;2.原核表达、纯化蛋白酶切割靶蛋白CAP2NC蛋白用以验证所表达的蛋白酶的活性;3.PR复性及对靶蛋白CAP2NC切割鉴定;4.PR对靶位点CAP2和NC之间切割位点进行了随机化展示的噬菌体文库切割。1. HIV-1型HXB2株蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化根据HIV-1 HXB2株PR及CAP2NC DNA序列设计引物,用重叠延伸PCR方法合成使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,并在PR序列上游添加自切割位点GTVSFNF 8个氨基酸的编码序列,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体进行测序。将PR DNA克隆至原核表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL-21 DE3诱导表达,表达出相对分子质量为30 000的HIV-1 PR融合蛋白。用Ni-NTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,纯化的目的蛋白浓度为2.54mg/ml。2. HIV-1型HXB2株蛋白酶靶蛋白CAP2NC蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化根据HIV-1 HXB2株CAP2NC DNA序列设计引物,用重叠延伸PCR方法合成使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 CAP2NC的DNA编码序列,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体进行测序。将CAP2NC DNA克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中进行诱导表达,表达出相对分子质量为34 000的CAP2NC蛋白,用Ni-NTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,将纯化的CAP2NC蛋白进行透析复性,复性后浓度为5.33mg/ml。将复性后的CAP2NC蛋白与复性好的PR蛋白酶混合过夜,SDS-PAGE显示CAP2NC蛋白被有效切割。3.HIV-1蛋白酶复性及对靶蛋白CAP2NC切割鉴定在对PR进行复性的工作中,我们尝试了稀释复性、透析复性、脉冲式透析复性三种复性方法,分别使用PBS复性缓冲液(0.01M PBS ,10%甘油,2mM DTT ,pH7.0)、醋酸钠复性缓冲液(50 mM醋酸钠, 10%甘油, 2mM DTT ,pH5.2)、MES复性缓冲液( 20mmol/LMES ,2 mmol/L DTT,10%甘油,PH 5.5)、Tris·HCl复性缓冲液(0.01M Tris,10%甘油, 2mM DTT, pH5.2)四种缓冲液,最终显示使用MES复性缓冲液( 20mmol/LMES ,2 mmol/L DTT,10%甘油,PH 5.5)进行稀释复性效果较好,复性后的PR能将靶蛋白CAP2NC ,该切割作用能被PI药物Indinavir抑制。4.HIV PR对展示PR靶位点P2/NC序列随机突变噬菌体文库的切割实验将本课题组构建的展示PR靶位点P2/NC序列随机突变噬菌体文库传代培养,得到的次代噬菌体稀释至1012TU/ml,各取100μl加入人Ig包被的ELISA板条中,37℃放置1h用洗涤液洗5次;每孔加入PR 5 ug,37℃切割2小时。以上每噬菌体样本均设未加噬菌体的空白对照*及未加PR的阴性对照**,结果显示我们构建的HIV PR不具有对展示PR靶位点P2/NC序列随机突变噬菌体文库的切割能力。本研究成功原核表达了包含自切割位点GTVSFNF 8个氨基酸的HIV-1 HXB2株蛋白酶,获得了相对分子量30 000的融合蛋白;原核表达了蛋白酶靶蛋白CAP2NC蛋白,获得了相对分子量34 000目的蛋白;蛋白酶表达产物经Ni-NTA柱亲和纯化及MES复性缓冲液稀释复性后,可将相对分子量34 000的靶蛋白CAP2NC体外切割成分子量大小为26 000、8 000两个较小的片断,证实了所表达的PR的切割活性;该切割反应能被PR抑制药物Indinavir所抑制,证实了切割反应的特异性。本研究表达、纯化的HIV-1蛋白酶可应用于对HIV-1 Gag P2/NC蛋白酶切割位点序列随机突变的噬菌体展示文库进行切割筛选,为构建新的蛋白酶抑制剂类药物体外筛选模型打下了基础。