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目的:
调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)是机体重要的免疫调节功能细胞,能下调免疫反应维持机体免疫耐受,它在肿瘤免疫、移植免疫和自身免疫病中均发挥重要作用。但Treg细胞在胃癌不同类型组织的表达情况、异常增高机制及免疫抑制功能尚未阐明。本研究拟探讨:建立体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞准确的检测方法并研究其在不同分期胃癌患者各类型组织的分布特点；CD127low/-定义调节性T细胞与Foxp3定义的一致性,探讨其与胃癌TNM分期的相关性；评估调节性T细胞对效应T细胞功能的影响；探索调节性T细胞在胃癌中异常增高及发挥免疫抑制的作用机制。从而为进一步揭示胃癌微环境的免疫逃逸机制及发掘Treg细胞潜在的临床应用价值提供实验依据。
方法:
根据Treg细胞表达特异性转录因子Foxp3的特点,建立CD4+CD25+Foxp3+流式细胞术、PCR和免疫组化等调节性T细胞的检测方法,分析其在胃癌的分布特点及意义。根据Treg细胞低表达CD127的特点,建立CD4+CD25+CD127low/-流式细胞术鉴定调节性T细胞,并比较其与特异性指标Foxp3定义的相关性,分析不同CD127亚群Foxp3的表达特征。比较以上两种方法在检测临床不同胃癌分期及不同组织类型中Treg细胞分布特点。利用CD4+CD25+CD127low/-这一指标分选调节性T细胞,探讨其对效应T细胞增殖的影响,明确胃癌患者和健康对照组之间外周血中Treg细胞抑制能力的差异。采用酶联免疫吸附技术(ELISA),检测不同分期胃癌患者外周血和腹水中PGE2、TGF-β1、白细胞介素10(IL-10)等的表达水平并分析其与Treg细胞、Foxp3蛋白表达强度的相关性,评价胃癌的免疫状态并探讨调节性T细胞异常增高与胃癌中PGE2、TGF-β1、IL-10等浓度水平的关系；根据胃癌微环境中存在异常增高的活化诱导的Treg细胞而且Treg细胞产生COX-2、PGE2并可能通过此机制抑制效应T细胞,通过建立共培养模型及COX-2抑制剂和EP2/EP4拮抗剂,阐述Treg细胞是否通过这一途径对效应T细胞增殖的产生免疫抑制。
结果:
1.调节性T细胞在胃癌的分布特点:应用Foxp3-FITC/CD25-PE/CD4-PerCP/CD3-APC四色流式细胞术检测Treg细胞胃癌的组织分布表明,调节性T细胞占CD4+T细胞的比例依据不同类型组织呈现出特征性分布:肿瘤组织>癌旁淋巴结>腹水>外周血。对Treg细胞在不同胃癌分期各组织的分布的分析表明,胃癌早期(TNMⅠ期和Ⅱ期)患者与晚期(TNMⅢ期和Ⅳ期)患者相比,外周血、腹水、癌旁淋巴结和肿瘤组织Treg细胞所占比例有显著差异(P<0.05)。应用定量实时荧光定量PCR对PBMCFoxp3 mRNA的相对表达量进行检测,发现肿瘤患者PBMC中Foxp3的表达高于正常对照(P<0.01),且Foxp3 mRNA表达量随着肿瘤进展而升高,晚期(TNMⅡ期、Ⅲ期和Ⅳ期)与胃癌早期(TNMⅠ期)比较,Foxp3 mRNA的相对表达量显著上升(P<0.01)；Foxp3+免疫组织化学染色发现晚期胃癌患者Foxp3+调节性T细胞所占比例显著高于早期患者(P<0.01)。但胃癌中Treg细胞的比例与胃癌病理分化程度的高低无明显相关性,在伴有有淋巴结转移的胃癌患者的癌旁淋巴结和肿瘤浸润淋巴细胞中的Treg细胞比例均高于无转移的胃癌患者,具有显著差异(P<0.05)。
2.CD4+CD25+CD1271low/-定义调节性T细胞:CD25联合CD127指标能有效地对调节性T细胞实行分选和鉴定,可作为Treg细胞的膜表面标志物进行Treg细胞的功能研究。对57例胃癌患者和20例健康对照PBMC进行Foxp3-FITC/CD127-PE/CD25-APC/CD4-PerCP/CD3-PC7五色胞浆和胞膜染色,分析CD4+T细胞中CD4+CD25+CDl27low/-细胞所占百分比与CD4+CD25+Foxp3+T细胞所占百分比的相关性。结果表明两者显著相关(相关系数r=0.9552,P<0.01)。检测不同CD127亚群中Foxp3+细胞群的比例及其Foxp3蛋白表达的强弱,发现CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞是表达Foxp3+细胞群比例最高,也是Foxp3蛋白表达水平最强的群体,提示这群细胞为功能性Treg细胞。分析57例胃癌患者CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞的组织分布和TNM分期特点,与CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞相似,证明CD127指标作为Treg细胞膜表面标志物的可行性。
3.调节性T细胞的免疫抑制功能:利用流式细胞术检测Foxp3的平均荧光强度评价Treg单个细胞水平Foxp3的表达强度发现,在胃癌的局部(包括癌旁淋巴结和胃癌组织浸润性淋巴细胞)中Treg细胞的Foxp3表达强度显著高于胃癌外周,具有显著差异(P<0.05)。而且随着胃癌分期增高,Treg细胞Foxp3的表达强度也增高。其中在胃癌肿瘤组织内,TNMⅣ期患者Treg细胞Foxp3的表达强度显著高于TNMⅠ期患者,具有显著差异(P<0.05)。体外共培养实验表明,当Treg细胞和效应T细胞比例为1:1时,Treg细胞能明显抑制效应T细胞增殖。且相比健康对照,来自胃癌患者的Treg细胞具有明显的抑制活性(P<0.05)。
4.不同分期胃癌患者PGE2,TGF-βp和IL-10的表达水平随肿瘤进展升高,血清中三种细胞因子表达水平均与CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞所占比例存在显著的相关性(P<0.01),而且PGE2的水平(血清和腹水)、TGF-β(血清)和IL-10(血清)的表达水平与Treg细胞Foxp3的表达强度存在一定相关性。胃癌局部微环境中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达COX-2蛋白,且COX-2的表达量与Foxp3蛋白的表达量相关(P<0.01)。在共培养实验中发现应用COX抑制剂和COX-2特异性抑制剂均能阻断Treg细胞分泌PGE2,并且能够降低Treg介导的对效应T细胞增殖的免疫抑制作用。同时单纯应用PGE2在效应性T细胞上的受体EP-2/EP-4的拮抗剂发现同样可以降低Treg的免疫抑制作用。
结论
1.CD4+CD25+Foxp3+T细胞是体内独特的调节性T细胞亚群,CD4+CD25+CD127low/-膜表面标记与CD4+CD25+Foxp3+相一致,可作为有效膜标志进行鉴定并分选Treg细胞。
2.流式细胞术、免疫组化以及实时荧光定量PCR等多种方法均证实:相比健康对照组,胃癌患者调节性T细胞比例异常增高,并呈现肿瘤组织>癌旁淋巴结>腹水>外周血的组织分布特点；且各组织中调节性T细胞比例的异常增高与胃癌TNM分期和肿瘤转移关联密切,手术切除肿瘤后患者Treg细胞明显降低,检测Treg细胞可用于辅助胃癌进展和预后判断。
3.CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞能明显抑制同源CD4+效应T细胞的增殖。来自胃癌患者高表达Foxp3的调节性T细胞具有明显的免疫抑制活性,并且在胃癌晚期患者中Treg细胞的抑制功能增强。
4.胃癌免疫状态紊乱；不同分期胃癌患者外周血和腹水中PGE2,TGF-β和IL-10的表达水平随肿瘤进展升高,且血清中三种细胞因子表达水平与外周血单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞所占比例存在显著的相关性,且与Treg细胞Foxp3的表达强度存在一定的相关性,提示这些细胞因子参与诱导胃癌中调节性T细胞的异常增高。
5.胃癌中调节性T细胞可通过COX-2-PGE2-EP2/EP4通路对效应T细胞的增殖发挥抑制作用,表明在肿瘤中异常增高的调节性T细胞介导的众多免疫抑制机制的重要一种。