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第一部分吸入麻醉药对草履虫细胞内钙库的影响及机制研究目的采用Mag-Fura2, AM荧光指示剂,直接观察吸入麻醉药及CaM抑制肽MLCK peptide对草履虫细胞内钙库Ca2+荧光比值的影响,探讨吸入麻醉药引起草履虫细胞内Ca2+升高的机制。方法破膜后的草履虫分别给予0.8EC50、1.0EC50、1.2EC50浓度的乙醚、安氟醚、异氟醚、七氟醚,5μM和10μM MLCK peptide及10μM的MLCK peptide对照剂MLCK peptide control,分别观察它们对草履虫细胞内钙库Ca2-荧光比值的影响。最后,以5μM MLCK peptide预处理破膜后的草履虫细胞5min,然后给予1.2EC50的安氟醚,同时监测草履虫细胞内钙库的Ca2+信号变化。本实验采用双波长荧光法监测Ca2+信号。结果吸入麻醉药与MLCK peptide均能引起草履虫细胞内钙库Ca2+荧光比值的降低,而MLCK peptide control对Ca2+荧光比值无影响。1.2EC50的安氟醚作用于经5μM MLCK peptide预处理的草履虫,不再引起其体内Ca2+信号的变化。乙醚、安氟醚、异氟醚及七氟醚的0.8EC50、1.0EC50、1.2EC50浓度分别为7.6,9.5,11.4mM、0.42,0.52,0.62mM、0.25,0.31,0.37mM以及0.47,0.59,0.71mM。结论MLCK peptide通过抑制CaM导致草履虫体内钙库释放Ca2+。吸入麻醉药也能够引起草履虫细胞内钙库释放Ca2+,而MLCK peptide预处理消除了吸入麻醉药的Ca2+释放作用,表明两者引起Ca2+释放的作用可能出于同一种机制。第二部分Ca2+螯合对吸入麻醉药在草履虫上双向效应的影响目的探讨吸入麻醉药引起草履虫细胞内Ca2+升高的生物学效应。方法草履虫细胞分为对照组和BAPTA组.,BAPTA组以5μM BAPTA-AM与草履虫细胞共孵育以螯合草履虫细胞内的Ca2+。分别给予0.8EC50、1.0EC50、1.2EC50的乙醚、安氟醚、异氟醚及七氟醚,显微镜下观察并摄像草履虫的游动情况,以Motion Analysis1.2软件分析草履虫游动的变化,分析比较吸入麻醉药对两组草履虫游动的影响。乙醚、安氟醚、异氟醚及七氟醚各自的0.8EC50、1.0EC50、1.2EC50浓度分别为7.6,9.5,11.4mM、0.42,0.52,0.62mM、0.25,0.31,0.37mM以及0.47,0.59,0.71mM。结果BAPTA组的草履虫相对于对照组,给予吸入麻醉药后,前期兴奋反应(游动加快)消失,后期抑制反应(游动减慢)减弱。结论吸入麻醉药诱发的草履虫细胞内的一过性Ca2+升高是吸入麻醉药引起草履虫兴奋效应的根本原因,也是吸入麻醉药对草履虫产生抑制作用的因素。第三部分吸入麻醉药影响CaM结构和功能的体外研究目的通过体外实验研究吸入麻醉药对CaM结构和功能的影响,探讨吸入麻醉药的可能作用位点。方法疏水区荧光指示剂ANS可以指示CaM疏水区的存在,实验分为对照组、EGTA组及各吸入麻醉药组,分别测定各组样品中与CaM共存的ANS的荧光光谱。高效液相色谱(HPLC)分析吸入麻醉药对CaM依赖的磷酸二酯酶1(PDE1)活性的影响。本实验所用的吸入麻醉药包括乙醚、安氟醚、异氟醚以及七氟醚,它们的0.8EC50、1.0EC50、1.2EC50浓度分别为7.6,9.5,11.4mM、0.42,0.52,0.62mM、0.25,0.31,0.37mM以及0.47,0.59,0.71mM。结果EGTA组：ANS的荧光强度大幅降低；对照组：由于Ca2+的存在,ANS的荧光强度大幅增强；吸入麻醉药组：相对于对照组,ANS的荧光强度被不同浓度的吸入麻醉药呈剂量依赖性地抑制。HPLC结果显示在吸入麻醉药的存在下,cAMP的水解产物AMP明显减少。结论：ANS在Ca2+的存在下能够作用于CaM的疏水区而引起荧光强度的大幅增强,而吸入麻醉药能够抑制ANS的荧光增强,表明吸入麻醉药能够与ANS竞争性结合CaM疏水区。吸入麻醉药的存在使cAMP的水解产物减少,表明吸入麻醉药可以抑制PDE1的活性,也暗示吸入麻醉药能够抑制CaM对下游某些酶的激活能力。研究结论1吸入麻醉药可以引起草履虫体内钙库释放Ca2+。2CaM抑制肽MLCK peptide,相对于它的对照剂MLCK peptide control,可以引起草履虫胞内钙库释放Ca2+,证明MLCK peptide对草履虫的Ca2+释放作用是出于对CaM的抑制。3预先给予CaM抑制肽MLCK peptide (?)肖除了吸入麻醉药对草履虫钙库中的Ca2+释放作用,表明吸入麻醉药引起的Ca2+释放是由于对CaM的抑制。4撤销吸入麻醉药引起的草履虫体内的一过性Ca2+释放作用消除了吸入麻醉药对草履虫的一过性兴奋作用,表明吸入麻醉药引起的一过性Ca2+升高是导致草履虫兴奋作用的根本原因。5撤销吸入麻醉药引起的草履虫体内的一过性Ca2+释放作用减弱了吸入麻醉药对草履虫的抑制作用,表明吸入麻醉药引起的一过性Ca2+升高可能参与吸入麻醉药对草履虫的抑制作用。6吸入麻醉药抑制了疏水区荧光指示剂ANS与CaM结合后的荧光强度增强,表明吸入麻醉药可与ANS竞争性结合CaM疏水区。7吸入麻醉药抑制了CaM依赖的磷酸二酯酶的水解cAMP的活性,表明吸入麻醉药可以抑制CaM对某些下游酶的激活作用。