第一部分孕早期经宫颈获取脱落滋养细胞的方法研究目的比较孕早期经过宫颈获取滋养细胞的几种方法,探讨适宜的取材方法,并检验其方法应用的敏感性和可靠性。方法选取早孕并要求终止妊娠的60名早孕妇女(孕6周～孕10周),在其知情同意后,分别采用3种方法经宫颈采集脱落细胞,随机分为三组,每组各20例:A组采用宫颈管棉拭子法,B组采用宫颈内口粘液吸引法,C组采用细胞刷法。选取20名未孕的妇女,在其知情同意后,行宫腔灌洗法采集的宫颈脱落细胞悬液作为对照组(D组)。收集后的宫颈脱落细胞的标本,行HE染色及免疫细胞化学染色,然后显微镜观察滋养细胞的存在情况,并计数细胞。免疫细胞化学染色选用的单克隆抗体细胞角蛋白-7(CK-7),与滋养细胞上的抗原发生特异性反应,观察阳性表达的细胞并计数。结果1.HE染色法:A组、B组、C组3种方法得到的标本中分别有8例(40%)、11例(55%)、18例(90%)标本中见滋养细胞。对照组的标本中均未见滋养细胞。A组的滋养细胞获得率与B组比较差异无统计学意义(p>0.05),C组的滋养细胞获得率较A组和B组高,差异有统计学意义(p<0.01,p<0.01)。2.免疫细胞化学染色法:A组、B组、C组3种方法得到的标本中分别有2例(10%)、5例(25%)、18例(90%)标本中见阳性表达的细胞。对照组的标本中均未见阳性细胞。A组的滋养细胞获得率与B组比较差异无统计学意义(p>0.05),C组的滋养细胞获得率较A组和B组高,差异有统计学意义(p<0.01,p<0.01)。3.三种方法采集滋养细胞的数量的比较:(1)HE法:3种方法中细胞刷法取得的细胞量最多,分别与宫颈管棉拭子组和宫颈内口粘液吸引组比较,其差异有统计学意义(p=0.002,p=0.002)。而宫颈管棉拭子组采集的细胞的量与宫颈内口粘液吸引组相比,其差异无统计学意义(p=0.605)。(2)免疫细胞化学染色法:三种方法中细胞刷法取得的细胞量最多。宫颈管棉拭子组中见阳性细胞的例数太少,无法进行比较。细胞刷法取得的滋养细胞量多于粘液吸引组,比较后其差异有统计学意义(p=0.000)。4.采集标本中滋养细胞的量与采集标本的孕周有一定的关系,本实验中,孕6周未采集到滋养细胞,从孕7周到孕10周随着孕周增加采集的标本中获得的滋养细胞数量增多(r=0.548,p=0.005)。5.滋养细胞的阳性率与孕妇的妊娠次数及标本的血污程度有一定关系(p=0.033,p=0.048),与孕妇的年龄和分娩次数无相关性(p=0.122,p=0.228)。结论1.从早孕妇女宫颈管获取滋养细胞是可行的。2.经宫颈细胞刷法取得的细胞量较多,成功率高。所以认为细胞刷法是一种较好的微创取材方法。3.孕7周之后经宫颈获取滋养细胞的成功率较高,细胞量较多。第二部分荧光原位杂交技术用于宫颈滋养细胞的快速产前诊断目的研究荧光原位杂交(FISH)技术在快速产前诊断胎儿染色体数目的应用,探讨其对宫颈脱落细胞在产前遗传学诊断中的临床应用价值:通过比较两组的实验结果、吻合度和差异性,分析FISH技术在染色体数目检测中的快速性和准确性,并分析和常规染色体核型分析的优缺点。方法(1)分组:采集的脱落细胞经过富集和纯化后行FISH检测,作为实验组;并同时取对应孕妇的绒毛组织作为对照组,行常规的染色体核型分析。(2)滋养细胞纯化和富集:选取早孕并要求终止妊娠的20名妇女(孕8周～孕10周),应用前一部分的取材方法中较好的细胞刷法无菌取得的实验组样本,在排除精液污染后,经过相应处理去除粘液等步骤后,行差速贴壁法培养后收获细胞,尽可能的纯化和富集细胞。(3)滋养细胞的鉴定:取出一部分用细胞角蛋白-7(CK-7)行免疫细胞化学染色进行鉴定,并计数细胞量。(4)用FISH技术进行检测:FISH组的样本经过预处理、样本变性、探针变性、杂交及其后处理、荧光显微镜观察等程序。(5)常规染色体核型分析:对宫颈脱落细胞所对应的孕妇,人工流产时无菌操作获取绒毛,经过绒毛组织细胞培养的方法,染色体核型分析等步骤得到最后的结果。结果(1)细胞刷法所取的20例样本经过4天的培养后,培养成功的例数为18例(90%)。培养过的细胞在行免疫细胞化学染色鉴定后行细胞计数,细胞达到103个/ml-104个/ml。从培养成功的标本中取10例行FISH检测,结果显示标本和探针杂交良好,镜下观察见背景暗,荧光信号明亮清晰,10例均杂交成功。显示男胎7例,女胎3例,13、18和21号染色体的数目均正常。对照组中相对应的绒毛培养细胞染色体核型结果显示为男胎8例,女胎2例,13、18和21号染色体的数目均正常。(2)实验组和对照组的结果符合率为90%。FISH组每例标本耗时24h,虽然标本也需4天的细胞培养,所需细胞量还是相对较少的。通过差速贴壁法可以尽可能的去除一些母体细胞,能够在相对较短的时间内富集滋养细胞的数目,达到产前诊断的目的。绒毛组织一般需经历5-7天的培养才可以收获细胞。(3)应用国产探针进行标本检测的过程中,适当的改变探针的变性温度及胃蛋白酶的消化时间,并将之前用甲酰胺变性标本和洗涤标本的过程省去,因为甲酰胺易挥发并具有一定的致癌作用,在适度的修改步骤后,也能得出较好的结果。结论1.经细胞刷法采集的宫颈脱落细胞标本,可以经差速贴壁法富集并纯化滋养细胞。2.用FISH技术检测富集后的细胞,可以快速较为准确的诊断胎儿染色体数目,可能有应用于临床的前景。3.仍需不断改进临床取材方法和简便的富集分选细胞的方法,避免母体细胞的污染。