禽流感病毒(avian influenza virus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),A型流感病毒属(influenza virus A),是单链负股分节段RNA病毒,可感染禽类和哺乳动物。迄今为止,已发现19种血凝素(Hemagglutinin, HA)亚型和11种亚型的神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的流感病毒,除部分HA和NA亚型病毒仅在蝙蝠体内分离,绝大部分HA和NA亚型组合的病毒都能从野生水禽和家禽中分离到。H9N2禽流感病毒是其中的一个亚型,1966年第一株H9N2禽流感病毒(Avian Influenza virus)在美国的火鸡群中被分离鉴定,1992年我国广东鸡群中最早出现H9N2亚型禽流感病毒,1998年在全国范围内造成大流行,给我国养禽业造成巨大经济损失。H9N2亚型禽流感病毒宿主范围广泛,不仅能够感染家禽和多种野鸟及珍禽,也能够感染包括犬、猫、雪貂、猴,乃至人等多种哺乳类动物。H9N2禽流感病毒感染家禽多表现为为低致病性,但是会引起产蛋下降及呼吸道症状并常伴有继发感染并导致死亡,在集约化养殖场中发病率高、传播速度快、对养禽业造成巨大经济损失。气溶胶传播是流感病毒感染宿主的一个重要途径,与直接接触导致的感染相比,它在一个群体中的波及面更广,传播速度更快。因此,了解气溶胶传播的相关分子机制对于防控H9N2禽流感疫情具有重要意义。本研究从本室分离的禽流感病毒中筛选出遗传背景接近但气溶胶传播能力差异的H9N2病毒A/chicken/Shanghai/7/2000(SH7)和A/chicken/Shanghai/14/2000(SH14),以它们作为研究对象,发现HA的363位氨基酸和PA的672位氨基酸是影响病毒气溶胶传播能力的关键因素,并就这些关键位点对病毒聚合酶活性、酸稳定性、热稳定性的影响进行综合分析,研究影响H9N2亚型禽流感病毒的气溶胶传播能力的分子机制。并进一步研究了在流感病毒中移码产生的PA-X蛋白对于H9N2病毒传播能力和致病性的影响。1、气溶胶传播能力不同但遗传背景接近的H9N2亚型禽流感病毒的筛选对于流感病毒而言,传播效率越高,导致大流行的概率也就越大。监测近年来的H9N2禽流感病毒与不同唾液酸受体结合的亲和性、气溶胶传播能力以及生物学特性在流行毒株中所占的比例有利于防控流感疫情的发生与发展。本研究测定了5株分离自同一肉鸡养殖企业基因同源性较高的H9N2禽流感病毒在鸡群中气溶胶传播能力、SPF鸡的排毒情况和抗体转化水平表明SH7和SHl这两株毒株能够通过气溶胶途径感染SPF鸡,而SH2、SH3和SH14则不能。我们构建并拯救了携带GFP的SH7重组病毒TNG。7NG病毒与母本病毒SH7一样从排毒和血清转化水平均表现出能够感染传播组的动物,我们通过冰冻切片也发现,病毒能够有效地在气管及肺部复制,并发出绿色荧光。这说明气溶胶途径确实能够感染易感动物,并且通过荧光病毒我们能够直观、快速的监测病毒在宿主体内复制、定殖以及组织分布。以SH7病毒作为能够进行气溶胶传播的毒株的代表,SH14为不能进行气溶胶传播的毒株代表,对他们的热稳定性、复制能力和唾液酸受体亲和性进行分析。结果表明不能传播的SH14对热稳定,而SH7不稳定。通过病毒在细胞上的生长曲线发现气溶胶传播差异的SH7和SH14在不同细胞上的复制没有显著差异,但在病毒复制的初期,SH7的病毒滴度高于SH14。这可能因为SH7在感染初期,能够有效感染细胞的病毒粒子数较多。H9N2禽流感病毒在近年来的进化过程中HA受体结合位点的氨基酸逐渐进化为偏嗜α-2,6唾液酸受体,因此它的宿主谱已经波及到多种哺乳动物。我们对SH7和SH14的不同糖链的结合效率进行测定,结果发现能够传播的SH7唾液酸受体结合特性更倾向于结合在哺乳动物中广泛存在的α-2,6唾液酸受体,而不传播的SH14更倾向于结合在禽类中广泛存在的α-2,3唾液酸受体。这种受体亲和性的差异是否与气溶胶传播能力有直接关系还需要进一步研究。但这说明能够进行气溶胶传播的SH7有突破种间屏障感染哺乳动物的可能,这具有重要的公共卫生意义。2、H9N2亚型禽流感病毒气溶胶传播相关的病毒基因和关键氨基酸位点的确定近年来,H9N2禽流感病毒在A型流感大家族中屡屡参与不同亚型病毒之间的重组,形成多种重组病毒,严重威胁公共卫生安全。为了进一步研究H9N2禽流感病毒的气溶胶传播机制,我们构建了SH7和SH14的各片段反向遗传质粒,并通过片段间重组获得了一系列的重组病毒。以SH7病毒为骨架,逐个替换SH14的单个基因片段,拯救病毒。其中重组病毒7-14PA和7-14HA失去了气溶胶传播的能力,在实验中不能感染气溶胶传播组的动物。而7-14NP和7-14NS病毒的气溶胶传播能力相较于母本病毒SH7而言有所下降,即气溶胶传播组的动物排毒和血清转化水平都下降了。因此,我们又以SH14病毒为骨架,替换SH7的PA、HA、NP和NS基因。获得的重组病毒14-7PA和14-7HA都无法进行有效地气溶胶传播,但14-7 (PA+HA)病毒可以。进一步将SH7的NP和NS基因替换入SH14,获得14-7 (PA+HA+NP)、14-7 (PA+HA+NP)和14-7 (PA+HA+NP+NS)病毒,它们的气溶胶传播能力比14-7 (PA+HA)高,传播组的动物排毒水平和血清转阳水平都比14-7 (PA+HA)高。尤其是14-7 (PA+HA+NP+NS),他的气溶胶传播能力已经与SH7相近。因此,PA和HA基因是影响H9N2禽流感病毒气溶胶传播的关键基因,NP和NS基因对传播有辅助作用。相应氨基酸的点突变病毒。气溶胶传播实验结果表明HA的363位氨基酸和PA的672位氨基酸突变能够改变病毒的气溶胶传播能力。从本室分离的H9N2禽流感病毒中随机挑选了15株病毒,测定他们的气溶胶传播能力并对他们的PA和HA基因进行分析发现,病毒必须同时是PA的672位亮氨酸和HA的363位赖氨酸才具有气溶胶传播能力。3、气溶胶传播的相关基因和氨基酸影响气溶胶传播的机制为了进一步研究与气溶胶传播相关的基因以及氨基酸影响病毒传播能力的机制,我们对SH7、SH14以及两株SH7的点突变病毒对鸡感染能力评估进行评估,结果发现能够进行气溶胶传播的SH7病毒感染能力优于不能传播的病毒。从感染试验排毒水平发现,SH7和SH14感染SPF鸡引起的喉头排毒没有显著差异,但SH7的泄殖腔排毒水平略高于SH14。点突变病毒7PAL672F和7HAK363R感染后动物喉头排毒的水平略微下降,但是并没有明显改变病毒对宿主组织的嗜性,因为泄殖腔的排毒也下降了。PB2、PB1、PA和NP基因共同组成流感病毒的聚合酶基因,对于流感病毒在宿主体内复制与转录有着重要影响。我们测定了病毒的聚合酶活性,发现不能传播的SH14病毒的聚合酶活性是SH7的三倍,这表明SH14在宿主细胞中的繁殖速度比SH7快,相同数量的SH7和SH14进入宿主细胞,SH14复制出的能够装配成子代病毒的数目要高于SH7。同样地,PA672位点突变失去气溶胶传播能力的病毒,它的聚合酶活性也高于能够传播的SH7。将SH7与气溶胶传播相关的PA和／或NP基因与SH14的PB2、PB1组合,他们的聚合酶活性介于SH7和SH14之间,但是这种聚合酶组合的病毒能够进行气溶胶传播。虽然聚合酶活性相关的病毒复制能力与病毒的毒力呈正相关,但是我们认为这与病毒传播能力之间没有明显的相关性。我们通过对病毒的热稳定性和酸稳定性测定发现HA和PA这两个能够影响病毒气溶胶传播能力的基因同时也影响了重组病毒的热稳定性,并且PA的672位氨基酸也影响了病毒的热稳定性。SH7在较广的pH值溶液范围(pH5.2～pH 7.2)内都能够保持良好的感染性,而SH14与SH7的HA 363位氨基酸点突变病毒(7HAK363R)的酸稳定性都大幅度下降。这说明SH7相对于SH14和7HAK363R而言,能够更好地适应宿主动物的呼吸道环境,并能够存留更长的时间而不致失活。对GenBank中H9N2病毒序列统计分析发现,PA672L且HA363K的病毒在整个H9N2病毒库中所占的比例呈逐年上升的趋势。我们推测具有气溶胶传播能力的H9N2禽流感病毒在环境中存在,这对防控流感疫情提出更高的挑战。4、H9N2禽流感病毒PA-X蛋白功能初探2012年人们报道了流感病毒基因组编码的一个新蛋白PA-X,该蛋白由PA的N-末端191个氨基酸以及移码产生的61个或41个氨基酸共同组成,序列保守。PA-X能降低1918年H1N1大流行流感病毒的致病性,但是PA-X对H9N2禽流感病毒的功能尚不清楚。我们构建并拯救了SH7的PA-X蛋白缺失株7PAXD。通过实验我们发现PA-X的缺失使7PAXD相较于母本病毒SH7对小鼠的致病力下降了,7PAXD造成的小鼠肺部炎症比SH7轻微。但是PA-X缺失后的病毒在体内和体外的复制能力并没有表现出明显的差异。同时我们还发现,PA-X的是否表达对于H9N2病毒的气溶胶传播能力也没有显著的影响。将野生型SH7病毒和7PAXD病毒感染小鼠后采集的肺脏组织进行细胞因子蛋白质水平的检测,并进行系统分析,我们发现SH7相较于7PAXD病毒而言能够诱导更为强烈的炎症反应,炎性细胞因子均不同程度上调表达。这虽然与已经发表的H1N1流感病毒中PA-X蛋白能够降低病毒致病性的结果有所差异,但是H9N2禽流感病毒对哺乳动物和禽类都是低致病性病毒,因此我们推测PA-X蛋白作为流感病毒的非必须蛋白是协助病毒更好适应环境的辅助蛋白。我们的数据首次提供了H9N2禽流感病毒PA-X蛋白的生物学作用数据,推进了人们对于PA-X蛋白在流感病毒中功能的认识。