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目的:
1.研究浙江汉族人线粒体DNA中Cytb基因和剑桥标准序列(rCRS)的差异,筛查Cytb基因变异的位点,以分析是浙江汉族人的多态性位点还是引起2型糖尿病的突变位点。
2.探讨线粒体Cytb基因变异与2型糖尿病主要临床生化指标及并发症的相关性。
方法:
1.根据1999年WHO糖尿病诊断标准,随机选取浙江汉族人群中确诊为T2DM的无血缘关系患者203名,对所有患者作常规生化指标检测并记录基本临床资料。同时选取102例年龄、性别匹配无糖尿病家族史及口服葡萄糖耐量正常者的血液标本作为对照。
2.提取全血基因组DNA,用特定的针对整个Cytb基因区域的两对引物扩增出PCR产物并纯化。对PCR纯化产物直接测序分析。
3.使用生物信息学软件(DNAstar和Chromas)进行比对分析,查找变异位点。借助生物信息学软件ClustalX及蛋白相关数据库,分析氨基酸变异情况和Cytb蛋白结构,并结合统计学方法分析Cytb基因变异与T2DM及其并发症的相关性。
结果:
1.在203名T2DM散发患者Cytb基因中共检测到76个变异位点,在正常对照组中检测到46个变异位点。所有位点发生率在两组间差异无显著性。其中C14766T、A153266在研究对象中检测到变异率均大于99%。
2.在T2DM组中的28个错义变异中,24个变异位点导致了氨基酸性质的改变。其中由非极性疏水性氨基酸转变为极性中性氨基酸占多数,其次为由极性中性氨基酸转变为非极性疏水性氨基酸。
3.Cytb基因变异率在T2DM患者中发生的频率高于健康对照者,差异具有显著性(P<0.05)。
4.在T2DM患者中部分变异发生在保守的区域,其在20种哺乳动物中呈现高度保守,尤其是位点G15024A(Cys93Tyr)、G15119A(Ala125Thr)、C15409G(His221Gln)、G15497A(Gly251Ser),这四个位点在健康对照组中未检到。
5.变异位点T14783C、G15043A、G15301A在肥胖组(BMI≥25kg/m2)的发生率高于非肥胖组(BMI<25kg/m2),差异具有统计学意义(P<0.05)。
6.变异位点T14783C、G15043A、G15301A在高血压患者中发生率高于未并发高血压患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论:
1.Cytb基因是一个高变的基因片段,在T2DM患者和健康对照人群中表现出较高的变异率,其变异率在T2DM患者中发生的频率高于健康对照者,这些变异位点大多数为多态性位点。
2.C14766T、A15326G在研究对象中检测到变异率均大于99%。是欧洲人群中少见的多态性位点,这两个位点可成为中国人群mtDNA序列的参考位点和对来源于欧洲人群的剑桥参考序列的一个修正。
3.变异位点T14783C、G15043A、G15301A均有较高的发生率,且总是同时出现。这三个位点在肥胖和伴发高血压的T2DM患者中发生率较高,表明某一单倍型(含T14783C、G15043A、G15301A变异)的个体更具有发生糖尿病、肥胖和高血压等疾病的可能性。