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骨髓造血微环境是支撑和调节造血干/祖细胞生长发育的内环境,骨髓基质细胞作为其重要组成之一,在造血干细胞的静止、分化、增殖和凋亡过程中起着重要的作用。骨髓增生异常综合征(MDS)是一组起源于骨髓造血干细胞的髓系恶性克隆性疾病,化疗是治疗高危MDS患者的常规手段,但在临床上部分MDS患者出现不同程度的耐药性,研究表明,除了恶性克隆细胞自发的耐药特性之外,骨髓造血微环境的异常对恶性克隆细胞耐药性的产生也具有重要作用,但具体的作用机制尚不清楚。在前期工作中,本实验室通过小鼠移植模型发现两株骨髓基质细胞HS5和HS27a对髓系恶性克隆细胞增殖的影响具有显著差异;通过多组学手段发现,HS27a中β-1,4-半乳糖基转移酶(B4GALT1)的表达显著高于HS5。本研究发现将髓系恶性克隆细胞株与HS5共培养后能显著增加HS5细胞中B4GALT1的表达。在HS5中过表达B4GALT1(HS5B4)并与髓系恶性克隆细胞共培养可以显著增强后者对化疗药物的耐药性。继而本研究探究了骨髓基质细胞中B4GALT1差异性表达的分子机制,并分别从细胞间直接接触、细胞因子介导、外泌体介导等3个方面系统地阐释了共培养体系中B4GALT1在基质细胞中介导髓系恶性克隆细胞产生耐药的分子机制,研究结果有望为MDS的临床治疗开拓思路。主要研究结果如下:(1)骨髓基质细胞中B4GALT1差异性表达的分子机制。本研究通过多组学的手段,发现HS27a细胞中B4GALT1的表达显著高于HS5细胞,并进一步通过双荧光素酶报告基因检测等方法,发现骨髓基质细胞中B4GALT1受JNK/c-Jun/AP-1调控,HS27a中c-Jun及其磷酸化的高表达导致HS27a细胞中B4GALT1的高表达。之后通过免疫荧光染色以及免疫组化,分析比较了5个健康志愿者和20个MDS患者骨髓基质细胞中B4GALT1以及其糖链产物LacNAc的表达,发现MDS患者骨髓基质细胞中B4GALT1和LacNAc的表达显著高于健康志愿者。(2)B4GALT1在基质细胞中以细胞间直接接触的方式介导髓系恶性克隆细胞耐药的分子机制。本部分实验发现在HS5细胞中过表达B4GALT1增强了HS5细胞与髓系恶性克隆细胞的黏附能力;将HS5/HS5B4细胞分别与髓系恶性克隆细胞共培养,用多柔比星或阿糖胞苷处理细胞后发现,与HS5B4共培养后的髓系恶性克隆细胞对化疗药物的耐药性显著高于与HS5共培养的细胞。之后本研究通过凝集素亲和质谱和凝集素免疫沉淀发现HS5B4细胞膜上Notch配体蛋白DNER的LacNAc糖链修饰显著增高。蛋白DNER上LacNAc的糖链修饰在半乳凝集素Galectin-1的参与下,能激活髓系恶性克隆细胞中的Notch1信号通路,以此提高髓系恶性克隆细胞对化疗药物的耐受力。(3)B4GALT1在基质细胞中以调节细胞因子的方式介导髓系恶性克隆细胞耐药的分子机制。本研究通过HS5和HS5B4的条件培养基分别处理细胞发现,HS5B4的条件培养基能显著提高髓系恶性克隆细胞对多柔比星或阿糖胞苷的耐药性。通过细胞因子芯片检测发现,HS5B4细胞条件培养基中趋化因子CXCL1的含量显著增加。CXCL1可降低髓系恶性克隆细胞活性氧水平并以此提高其对化疗药物的耐受。本部分结果证实在基质细胞中过表达B4GALT1,导致p53蛋白上LacNAc糖链修饰增多,泛素化水平上调,从而激活NF-κB信号通路,上调CXCL1表达。(4)B4GALT1在基质细胞中以调节其外泌体中包含的miRNA的方式介导髓系恶性克隆细胞耐药的分子机制。本研究通过超速离心分别提取HS5和HS5B4细胞的外泌体,并分别处理髓系恶性克隆细胞发现,HS5B4来源的外泌体能使髓系恶性克隆细胞对多柔比星或阿糖胞苷的耐药性显著增强。通过对外泌体中miRNA芯片检测发现,HS5B4来源的外泌体中miR-92a-3p显著增加。通过在KG1a中过表达miR-92a-3p证明了该miRNA能使KG1a对化疗药物的耐药性增强。