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破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF或称osteoprotrgerin,OPG)是最近发现的具有降血钙作用和防止骨流失的一种新的可以调节骨密度的分泌型糖蛋白。OPG作为一种新发现的蛋白质,具有很高的研究意义和开发价值。目前,OPG主要是通过CHO细胞表达体系来表达的,但这种方法表达量低,且成本高。所以我们的目标是利用基因工程技术,探索一种或几种理想的表达系统用以大量制备具有生物活性的重组蛋白。 破骨细胞形成抑制因子(OPG)对骨的重建与再吸收有重要调节作用,其TNF结构区行使抑制破骨细胞形成与活性的功能。通过PCR将该区基因片段扩增出来,命名为OPG-T。为了探讨利用大肠杆菌大规模生产重组OPG蛋白的可能性,将OPG、OPG-T及突变体基因OPG-372插入表达载体PET-28a质粒多克隆位点,重组质粒转入大肠杆菌BL21中分别进行表达研究。结果表明OPG和OPG-372存大肠杆菌中表达量较低。而OPG-T能得到高效表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体经变性复性后,亲合层析获得重组蛋白。纯化的产物作为抗原免疫兔,得到较高特异性的兔源多克隆抗体。利用小鼠降血钙实验检测所表达的重组蛋白OPG-T的活性,结果表明该蛋白有一定的生物活性。 由于大肠杆菌体系表达OPG不是太理想,我们将破骨细胞形成抑制因子OPG及变体OPG-372基因克隆于昆虫病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAK8-OPG、pBacPAK8-OPG-372,将它们与线性化的Bm-BacPAK6病毒DNA共转染家蚕细胞,经体内重组,挑斑筛选,获得Bm-OPG和Bm-OPG-372重组病毒。经Southern Blot分析,表明两种重组病毒基因组中分别含OPG和OPG-372基因。将Bm-OPG和Bm-OPG-372重组病毒分别在家蚕细胞和幼虫表达,SDS-PAGE和Western blot分析结果表明OPG、OPG-372基因被表达,并发现家蚕细胞表达的rh-OPG、rh-OPG-372分子量分别约为43kD和42kD,而在家蚕幼虫的表达产物分别约为55kD和46kD,rh-OPG在家蚕幼虫的表达产物还有二聚体的形式。 为了对OPG在家蚕表达体系中的表达情况进行进一步的研究,我们利用