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第一部分酶消化法分离培养人退变的颈椎间盘髓核细胞目的:从人的颈椎间盘髓核组织内分离培养髓核细胞并进行鉴定,镜下观察髓核细胞的生物学特性变化,为后续的研究提供重要的实验基础。方法:收集我院脊髓型颈椎病患者术中取出的髓核组织8例,经胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化后获得单细胞悬液并进行细胞培养和鉴定。镜下观察髓核细胞在培养过程中的形态学变化、生长速率并记录细胞贴壁时间和融合时间。结果:刚分离的髓核细胞多呈圆形,5-7天后细胞贴壁,细胞开始增殖,遗留的组织碎块边缘也开始出现细胞增殖,10-14天后细胞增殖加快,细胞呈三角形、短梭形,胞质伸出,细胞聚集成团。培养4周后细胞融合约85%,细胞轮廓欠清晰,外形欠饱满。传1代的细胞,培养2天内细胞增殖不明显,3-7天细胞增殖明显加快,进入对数生长期,10天之后细胞增殖减慢,进入平台期,此时髓核细胞数量达到峰值。随后细胞增殖和凋亡失衡,细胞数量开始呈下降趋势。刚分离的细胞贴壁时间和85%融合时间分别为7.1±2.9天和27.4±3.8天,而细胞传1代后细胞贴壁时间和85%融合时间明显缩短,分别为0.8±0.1天和9.1±2.3天。传至2代时,细胞贴壁时间和融合时间分别为0.7±0.2天和7.4±1.8天,与1代相比明显缩短具有统计学差异(P<0.05)。但细胞传至3代后,细胞贴壁时间为1.7±0.9天,而融合时间13.2±2.5天,两者均开始上升,差异具有有统计学意义(P<0.05)。结论:体外分离培养髓核细胞的过程中其增殖缓慢,培养周期较长,细胞形态也随着传代次数增多发生变化,逐渐呈老化趋势。因此要获取活性较好,纯度较高的髓核细胞比较困难,但对于组织工程椎间盘种子细胞的选择起到关键的作用。第二部分基于Miyazaki分级颈椎间盘内髓核细胞的生物学特性研究目的:探究不同Miyazaki分级的颈椎间盘内髓核细胞的生物学特性差异,进而评估颈椎间盘Miyazaki分级与椎间盘退变程度的一致性。方法:收集2017年12月-2018年7月我院骨科行颈前路椎体次全切除术(Anterior cervical corpectomy and fusion,ACCF)或颈前路椎间盘切除术(Anterior cervical discectomyand fusion,ACDF)的36例患者术中切除的颈椎间盘髓核组织,其中9例为双节段,27例为单节段,并按照Miyazaki分级分为4组,依次为Ⅱ级组(n=6),Ⅲ级组(n=10),Ⅳ级组(n=14),V级组(n=15)。其中男性为17人,女性为19人,平均年龄为43.2±5.1岁。获取椎间盘髓核组织后组织切片甲苯胺蓝染色和免疫组织化学染色观察髓核组织内细胞的密度分布以及Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白聚糖蛋白的表达情况。蛋白免疫印迹实验(Westernblotting,WB)进一步测定不同等级髓核组织内Ⅱ型胶原蛋白(Type Ⅱ collagen,ColⅡ)和聚蛋白聚糖(Aggrecan)的表达量。采用胰酶和Ⅱ型胶原酶共同消化分离髓核组织内的髓核细胞并进行培养和鉴定,台盼蓝染色测定各组髓核细胞的活性比率,光镜下观察髓核细胞的形态,并在培养过程中观察并记录不同代次和不同Miyazaki分级细胞的贴壁时间和融合时间;使用CCK-8法绘制不同Miyazaki分级组2代髓核细胞的生长曲线,比较各组之间的细胞生长速率。结果:随着颈椎间盘Miyazaki退变等级增高,组织内髓核细胞的密度降低,基质着色变浅,细胞周围的软骨陷窝也逐渐消失。髓核组织内细胞外基质中重要的Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白聚糖的表达量也逐渐降低。此外,颈髓核组织分离细胞培养后可见Ⅱ级椎间盘内髓核细胞呈三角形、短梭形,细胞轮廓清晰,折光性较好,Ⅲ级髓核组织内髓核细胞出现突起,伸出伪足,轮廓不清晰,Ⅳ级组髓核细胞突起明显,细胞形态多呈长梭形,而V级组的髓核细胞形态各异,轮廓模糊,细胞扁平,并且折光度也较差。分离髓核细胞后测得Ⅱ级组细胞活性比率为(94.1±4.6)%,Ⅲ级组活性比率为(84.5±6.2)%,Ⅳ级组活性比率为(77.5±5.8)%,而V级组的细胞活性比率为(66.4±4.9)%,组间两两比较均存在统计学差异(P<0.05)。分离获取的Ⅱ级组髓核细胞贴壁时间为108.5±19.2小时,Ⅲ级组为165.6±26.4小时,Ⅳ级组细胞贴壁时间为218.4±31.2小时,V级组贴壁时间为249.6±40.8小时,组间两两比较均具有统计学差异(P<0.05)。各组细胞第一次融合至可传代所需时间Ⅱ级组:21.4±2.4天,Ⅲ级组:26.5±2.5天,Ⅳ级组:30.2±2.9天,V级组所需时间为33.6±3.8天,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。在各组细胞培养过程中,细胞传至1-3代时贴壁时间和融合至90%时间均较P0代明显缩短,但P3代细胞贴壁时间和融合至90%的时间开始较P2代延长,且具有统计学差异(P<0.05),组间两两比较均具有统计学差异(P<0.05)。在1代髓核细胞培养过程中可见Miyazaki Ⅱ级组髓核细胞生长速率比Ⅲ级组快,Ⅲ级组比Ⅳ和Ⅴ级组的细胞生长速率快,Ⅳ级组比Ⅴ组快,且组间比较均存在统计学差异(P<0.05)。结论:颈椎间盘Miyzaki退变分级系统可以较好的在组织水平和细胞水平反映颈椎间盘的退变程度,句为该系统在临床上的运用提供理论依据,进而为颈椎退变性疾病的治疗和预后评估提供参考。