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对虾的养殖是我国沿海地区重要的水产支柱产业。但是白斑病毒(white spot syndrome virus, WSSV)等病毒使对虾养殖业遭受了极大的损失。因此,研究对虾的抗病毒先天免疫防御机制,对于预防和控制对虾疾病具有重要意义。1.对虾TRBP和eIF6之间存在直接的相互作用,并在对虾抗病毒RNAi途径中起作用HIV转录激活反应RNA结合蛋白(Trans-activation response RNA-binding protein, TRBP)是一种多功能蛋白,在多种生命进程中发挥重要作用。我们从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到三个TRBP家族成员,分别命名为Fc-TRBP1-3.我们在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达并纯化了Fc-TRBP1,随后使用纯化的Fc-TRBP1进行对虾血细胞T7噬菌体展示文库淘选,并得到中国明对虾真核翻译起始因子(Fc-eukaryotic initiation factor 6, Fc-eIF6)的部分序列。我们克隆得到Fc-eIF6的全长cDNA序列,并在大肠杆菌中进行重组表达。利用pull down实验验证了TRBP和eIF6之间存在直接的相互作用。RT-PCR和Northern blot结果表明Fc-TRBP和Fc-eIF6在所有检测的组织中都有表达,对虾受鳗弧菌刺激后在所有组织中表达有上调趋势,在对虾受到病毒刺激时TRBP和eIF6的表达模式在不同组织中有较大差异,在血细胞中呈现下调趋势而在鳃和肠中上调。Western blot结果验证了TRBP在肝胰腺和鳃中的表达模式。注射重组TRBP蛋白可抑制WSSV在对虾体内的复制。通过这些结果可以推测TRBP和eIF6可能在抗病毒免疫中起重要作用。随后我们在日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)中克隆得到TRBP和eIF6的全长序列。我们对日本囊对虾TRBP(Mj-TRBP)的不同结构域进行重组表达。pulldown实验证明TRBP结构域B,C介导与eIF6的结合。Gel-shift结果表明TRBP结构域A对dsRNA具有很高的亲和力,而结构域B亲和力很弱,结构域C不结合dsRNA但可通过介导TRBP全长分子的二聚化提高TRBP分子的亲和力。RNAi结果表明TRBP和eIF6参与dsRNA介导的RNA沉默,沉默TRBP和eIF6均可促进WSSV的增殖。以上结果表明,TRBP和eIF6可能通过抗病毒RNA沉默参与对虾抗病毒免疫。2.组织蛋白酶C参与对虾的抗病毒先天免疫组织蛋白酶C, (Cathepsin C, Cath C)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶,属于木瓜蛋白酶家族。Cath C能够激活许多糜蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶(chymotrypsin-like serine proteases)并在免疫和炎症细胞中参与调控许多丝氨酸蛋白酶的活性。在本研究中,我们克隆了中国明对虾Cath C的cDNA全长序列,命名为Fc-Cath C。Fc-Cath C的cDNA长1445bp,包含1356的bp开放读码框(open reading frame, ORF)编码了451氨基酸长度的蛋白包括17个氨基酸的信号肽。Real time PCR结果表明Fc-Cath C mRNA在肝胰腺中转录,并在受鳗弧菌Vibrioanguillarum和白斑病毒(white spot syndrome virus, WSSV)刺激后上调。通过向对虾体内注射Cath C的抗体后,可促进WSSV的增殖以及提高对虾受病毒感染后的死亡率。我们的结果表明Fc-Cath C可能在对虾的抗病毒先天免疫中起重要的作用。3.翻译控制肿瘤蛋白的基因克隆及功能研究翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein, TCTP)是一种多功能的蛋白,在许多生命过程中发挥重要的功能。我们从中国明对虾中克隆得到TCTP的cDNA全长序列命名为Fc-TCTP。Fc-TCTP cDNA长711bp,包含507 bp的开放读码框(open reading frame, ORF)编码了168氨基酸,包含一个TCTP结构域的蛋白。我们Fc-TCTP受到鳗弧菌刺激和WSSV刺激后的表达模式进行分析发现,在受到WSSV刺激后TCTP的mRNA和蛋白水平上的表达量显著上调。结果表明Fc-TCTP可能在对虾的抗病毒先天免疫中起重要的作用。