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在食品加工中蛋白质水解液通常会产生苦味,而这些苦味的产生是由水解液中多肽链末端的疏水性氨基酸引起的。亮氨酸氨肽酶(Leucine aminopeptidase)是一种外肽酶,它能够切除多肽或蛋白质N末端的疏水性氨基酸,从而能够在一定程度上去除蛋白质水解液的苦味,同时还可以促进蛋白质的水解。雅致放射毛霉(Actinomucor 是发酵腐乳的主要菌种,它具有丰富的肽酶酶系,对大豆蛋白具有良好的脱苦作用。目前已从雅致放射毛霉麸曲培养物中分离纯化出一种亮氨酸氨肽酶(LAP),其酶学性质得到初步研究,而基因克隆和异源表达相关研究未见报道。为了从雅致放射毛霉(A.elegans)中克隆亮氨酸氨肽酶基因(lap),并期望得到亮氨酸氨肽酶基因工程菌株。本实验以卷枝毛霉(Mucor circinelloides)假设的亮氨酸氨肽酶基因为参考,设计3对引物从雅致放射毛霉(A.elegans)和卷枝毛霉(M circinelloides)中克隆亮氨酸氨肽酶基因,并在毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)中进行诱导表达,对表达产物进行一系列检测,包括亮氨酸氨肽酶活力分析、SDS-PAGE和Western Blot,验证克隆的基因是否为亮氨酸氨肽酶基因。首先通过RT-PCR的方法,从A.elegans中克隆出编码LAP的片段Alap1,从M.circinelloides中克隆出编码LAP的5个不同的片段,分别是Mlap1、Mlap2-1、Map2-2、Mlap3-1和Mlap3-2,并对这6个片段进行测序。将这6个不同的片段和载体pPICZαA分别用EcoR|和Kpn|酶切,并用T4 DNA ligase连接,分别构建了 重组表达载体 Alap1-pPICZαA、Mlap1-pPICZαA、Mlap2-1-pPICZαA、Mlap2-2-pPICZαA、Mlap3-1-pPICZαA和Mlap3-2-pPICZαA。将重组表达载体和空载体用Sac|线性化处理,电转化至P.pastoris GS115。提取P.pastoris基因组DNA进行PCR验证,并在MDH和MMH平板上筛选Mut+(甲醇利用正常型),成功得到7个毕赤酵母重组子,分别命名为Alap1-pPICZαA-GS115、Mlap1-pPICZαA-GS115、Mlap2-1-pPICZαA-GS115、Mlap2-2-pPICZαA-GS 115、Mlap3-1-pPICZαA-GS 115、Mlap3-2-pPICZαA-GS 115和 pPICZαA-GS115。在0.8%的甲醇,200 rpm,30℃条件下对重组毕赤酵母进行诱导培养4 d,LAN法分析胞内和胞外亮氨酸氨肽酶活力,SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达。结果表明:所有重组毕赤酵母胞内和胞外无亮氨酸氨肽酶活性,目的蛋白没有成功表达。为了分析重组毕赤酵母目的基因是否转录,通过实时荧光定量PCR的方法,对Mlap1-pPICZαA-GS115中Mlap1的转录情况进行研究,结果Mlap1在细胞内已经转录,并且在36 h的转录水平是12 h的8.5倍。综合以上结果表明:从A.elegans和M.circinelloides中克隆得到的6个基因在细胞内已经转录,而且在不同的诱导时间转录水平不同,但是蛋白质没有成功表达,因而不能验证这6个基因是否为亮氨酸氨肽酶基因。