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研究背景:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是慢性乙型肝炎（Chronic hepatititis B,CHB）的主要原因。乙肝病毒携带者发展为慢性乙型肝炎后,其进一步转化为肝硬化（Liver cirrhosis,LC）以及肝细胞癌（Hepatocellulor carcinoma,HCC）的风险更高。目前,全球约有2.96亿人感染乙肝病毒,约88.7万人死于乙肝感染引起的终末期肝病,因此HBV感染仍是一个严重的公共卫生问题。临床治疗慢性HBV感染的药物主要包括核苷（酸）类似物（Nucleotide analogs,NAs）和聚乙二醇化干扰素α（PEG-IFN-α）。其中口服NAs可显著降低病毒载量并预防肝病进展,但NAs治疗停药后常常会出现病毒复制的反弹,严重时甚至会导致肝炎急性复发,而长期抗病毒药物治疗容易引起原发或继发性耐药;干扰素治疗仅能够使部分患者获得持续应答,并且可能出现不同程度的副作用。此外,上述抗病毒治疗方法都不能完全清除或持续沉默受病毒感染肝细胞中的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,ccc DNA）,也无法完全恢复机体抗病毒免疫应答功能,很难实现HBV的彻底清除,治愈率有限。因此寻找和研发新的治疗药物是临床抗乙肝病毒研究的当务之急。为解决目前临床抗病毒治疗中出现的NAs耐药、干扰素治疗受限且副作用明显等问题,靶向HBV生命周期特定环节的新型抗病毒药物的相关研究进展迅速。HBV病毒感染肝细胞后,进入细胞的HBV核衣壳变构解体,释放出其中的病毒基因组DNA即松弛环状DNA（relaxed circular DNA,rc DNA）和生物合成所需的一些蛋白质,通过一系列反应形成ccc DNA,即病毒的复制模板;ccc DNA通过转录生成病毒RNAs,其中前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）翻译产生P蛋白和核心蛋白,核心蛋白通过分子间的疏水作用力组装形成核衣壳,包裹pg RNA和一些蛋白质;在P蛋白的作用下pg RNA逆转录形成rc DNA,含rc DNA的核衣壳一部分被包膜包裹后被释放到细胞外开启新一轮的感染,一部分被运输回细胞核内补充ccc DNA池。因此,HBV核衣壳在病毒生命周期中的基因组包装、病毒运输等多个关键环节都发挥着重要作用,是HBV抗病毒治疗的一个潜在靶点。目前已有多种具有抗病毒效果的核心蛋白变构调节剂（Capsid assembly modulators,CAMs）相继被报道,但部分进入临床试验的药物由于单用抗病毒效果不佳,大多与NAs联合使用。而从已有的试验结果来看,NAs联合CAMs使用并没有显著促进ccc DNA的耗竭或沉默。在现有的临床试验中,CAMs治疗结束后相当一部分患者仍然出现了病毒学反弹,因此目前还没有经过批准上市能用于临床的CAMs。基于此,我们对化合物库中可能成为HBV核心蛋白变构调节剂的化合物进行筛选,以期找到靶向病毒衣壳的、具有理想抗病毒活性的优选化合物,为临床抗乙肝病毒治疗提供新的策略。实验方法:1.使用Autodock Vina程序在Linux计算集群上进行高通量对接筛选Chem Div和Vitas商业化合物库（～300万化合物）,挑选出24个潜在的活性化合物。对筛选出的化合物进行初步抗HBV活性测试,从中选取能够有效抑制病毒复制的先导化合物。2.通过研究化合物的构效关系,发现一系列具有抗病毒活性的化合物及其衍生物,并对其中优选出的HBV核心蛋白组装调节剂进行体外实验研究,分析不同浓度的化合物对HBV核衣壳的组装、s抗原（HBs Ag）和e抗原（HBe Ag）的分泌、3.5 kb RNA以及HBV core DNA、ccc DNA等的影响。3.使用免疫荧光显微镜和透射电子显微镜观察核心蛋白变构组装调节剂处理后细胞内HBc分布情况以及体外核衣壳组装的变化。实验结果:1.N-磺酰哌啶-3-甲酰胺类化合物及衍生物（N-sulfonylpiperidine-3-carboxamides,SPCs）通过靶向核心蛋白干扰正常衣壳的组装,进而影响HBV的正常复制周期,显著降低体外细胞上清分泌的HBe Ag、细胞内3.5 kb RNA、HBV DNA和HBc Ag表达水平。2.SPCs在体外对核苷酸类药物耐药的HBV突变体仍有明显抗病毒作用,并且与ETV联用可增强其抗病毒活性。3.SPCs通过诱导细胞内HBc核心蛋白发生聚集,影响体外核衣壳的组装。结论:新型HBV衣壳组装调节剂SPCs有望成为具有高抗病毒活性、耐药性及良好成药性的抗HBV候选药物或前体化合物,为临床抗病毒药物的优化和后续研发提供更多参考与选择。研究背景:慢性乙型肝炎（Chronic hepatititis B,CHB）是一个全球性的健康问题。近年来,因肿瘤患者接受化疗或移植术后免疫抑制剂的广泛使用,携带乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）的患者出现HBV再激活的现象明显增多。患者体内瞬时活化的HBV大量复制常常导致机体出现严重的肝损伤甚至是肝衰竭,致使治疗进程减缓或中断,进而耽误患者的有效治疗时间,对其预后造成严重影响甚至危及其生命。目前认为化疗药物引起HBV再激活的原因有两种:一是化疗药物抑制了机体的免疫系统,使病毒发生免疫逃逸,导致病毒大量复制,出现HBV再激活现象;二是化疗药物本身具有直接调控病毒复制的作用,从而引起HBV再激活。大多数学者认为第一种是化疗药物引起病毒再激活现象的主要原因,而对于一些化疗药物是否存在直接调控病毒复制的作用,还有待进一步研究。已获美国食品和药物管理局（FDA）批准的新型抗肿瘤药物Romidepsin（FK228）和Vorinostat（SAHA）是两种主要的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）。有研究报道称HDACi治疗后出现的病毒再激活现象是其严重的并发症之一,如感染EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）或人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus type 1,HIV-1）的患者经HDACi治疗后会分别出现不同程度的病毒再激活。因此,为了探讨药物HDACi引起HBV再激活的具体机制,我们重点研究了HDACi对乙肝病毒复制的直接调控作用,解析其可能的机制。以上研究为解决临床HBV再激活现象奠定了理论基础,也为临床乙肝病毒携带者的治疗提供了一定的参考依据。实验方法:1.采用ELISA法、实时荧光定量PCR法、Western blotting、Southern blotting等实验方法检测FK228/SAHA处理后HBV稳定复制的细胞和HBV转基因小鼠体内HBV相关病毒蛋白、HBV RNA和DNA水平的变化。2.采用ELISA法、实时荧光定量PCR法、免疫组织化学染色等实验方法检测FK228/SAHA处理后HBV转基因小鼠体内HBV复制相关RNA和DNA、蛋白表达的改变以及肝损伤相关指标ALT、AST的变化。3.采用流式细胞术、Western blotting等实验方法,研究FK228/SAHA处理后细胞周期分布和细胞周期相关蛋白含量的变化。实验结果:1.FK228/SAHA在体内外均明显促进HBV复制,且随着药物处理浓度的增加作用进一步增强。特异性HDAC1/2抑制剂FK228促进HBV复制作用较广谱抑制剂SAHA更明显。2.FK228/SAHA通过诱导细胞发生G1期到S期的细胞周期阻滞来促进HBV的复制。结论:本课题从分子水平解析HDAC抑制剂FK228/SAHA通过诱导细胞周期阻滞来促进HBV的复制,为进一步解析临床HBV再激活现象奠定基础。