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骨保护素(osteoprotegerin, OPG)发现于上世纪九十年代,它作为肿瘤坏死因子受体(TNF)超家族成员之一,能通过阻断核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和RANK结合来完成诱骗受体功能,从而抑制破骨细胞(OCs)的分化和活性。本课题组最新研究发现OPG可诱导体外成熟破骨细胞发生凋亡,这种凋亡可能是OPG抑制成熟破骨细胞活性的主要途径,然而OPG在OCs存活以及凋亡中的确切作用仍不清楚。随着我国养殖业集约化和规模化发展,动物骨营养不良性疾病的发生越来越多,目前仍缺乏高效的防控药物。本文以原代分离小鼠骨髓诱导分化为OCs及破骨细胞前体细胞(OPCs)为研究对象,OCs分化成熟后添加不同浓度OPG,通过TACS-XL Blue法(TUNEL凋亡检测衍生法)、实时荧光定量PCR (QRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)等技术手段,揭示OPG对OCs和OPCs凋亡中形态、功能、相关基因及关键信号蛋白的影响,以期阐明OPG诱导OCs和OPCs凋亡的分子机制,为相关药物的研发提供理论依据和新思路。研究内容如下：1.OPG诱导破骨细胞及其前体细胞凋亡为了研究OPG对体外培养小鼠OCs和OPCs凋亡的影响,取8-12周龄Balb/cJ小鼠的骨髓细胞,体外培养过程中采用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)+RANKL联合诱导分化为OCs和OPCs,作为OCs和OPCs细胞模型；同时运用仅添加M-CSF的培养基诱导为单一OPCs细胞模型,在体外培养5d,随后双细胞因子处理组去除RANKL,在两种模型中均分别加入不同浓度OPG((0、20、40、80ng/mL)进行处理。通过Annexin V-FITC荧光染色法,AnnexinV-PI流式法及TACS-XL Blue法,检钡OPCs的早期凋亡、晚期凋亡以及OCs的凋亡情况。结果显示,与对照组相比,OPG处理组OPCs的凋亡率显著增加(P<0.05),其中早期凋亡率及晚期凋亡率在40ng/mLOPG处理组达到最高值。与对照组相比,OPG处理组OCs的凋亡率显著增加,呈剂量—效应关系(P<0.05)。2.OPG对破骨细胞凋亡相关基因的影响为了研究OPG诱导OCs凋亡中凋亡相关基因的变化,采用M-CSF+RANKL诱导原代小鼠骨髓细胞分化形成OCs,在体外培养5d,去除RANKL,各组分别添加不同浓度的OPG (0、20、40、80ng/mL)。培养结束后收集OCs,提取总RNA和总蛋白,QRT-PCR和Western blot法检测凋亡相关基因转录及蛋白表达水平的变化。结果发现,OPG处理使得OCs中促凋亡基因Bax的转录水平显著升高(P<0.05),抑凋亡基因Bcl-2基因的转录水平极显著降低(P<0.01),呈剂量—效应关系。同时,Western blot结果表明,与对照组相比,随着OPG浓度的增加,Bax的表达量上升、Bcl-2的表达量下降,Bax/Bcl-2极显著增加(P<0.01)。表明OPG能通过促进促凋亡基因表达和抑制抑凋亡基因表达来诱导破骨细胞凋亡。3.OPG诱导OCs和OPCs凋亡的Fas/FasL死亡受体途径为了研究OPG诱导OCs和OPCs凋亡对Fas/FasL死亡受体途径的影响,在上述双因子处理诱导而来的OCs和OPCs中加入相应浓度的OPG和/或Fas/FasL死亡受体通路拮抗剂进行处理。通过QRT-PCR技术及Western blot等技术,研究OPG对OCs和OPCs的Fas/FasL死亡受体途径相关蛋白的转录和表达水平的影响。此外,酶联免疫吸附测定(ELISA)及Co-IP法检测可溶性FasL (sFasL)在细胞上清中浓度的变化,以及其与OPG的结合情况。结果显示,与对照组相比,20和40 ng/mL OPG能显著增加Fas的转录及表达水平和caspase-8的活化程度,但80 ng/mL OPG处理会显著地降低Fas的转录及表达水平(P<0.05)。同时,与对照组相比,OPG处理显著增加FasL的转录及表达水平,但上清中的sFasL含量显著减少(P<0.05)。运用Fas/FasL死亡受体途径的拮抗剂与OPG共处理能极显著减弱OPG处理引起的caspase-8和caspase-3活化增强(P<0.01)。Co-IP法检测发现OPG能与sFasL结合。这一结合会阻滞sFasL对OCs和OPCs凋亡的抑制作用。4.OPG诱导破骨细胞凋亡的线粒体途径为了研究OPG诱导OCs和OPCs凋亡的线粒体途径,在上述双因子处理诱导而来的OCs和OPCs中分别添加相应浓度的OPG。培养结束后收集细胞,通过Western blot法检测线粒体凋亡途径相关蛋白细胞色素C (cyt. c)的分布、caspase-9和caspase-3的活化水平,通过免疫荧光技术检测凋亡相关因子(AIF)和线粒体核酸内切酶G (Endo G)的核转位。结果发现,OPG处理能诱导OCs和OPCs中cyt. c从线粒体释放到胞浆,激活caspase-9和caspase-3,AIF和Endo G发生核转位。表明OPG能通过线粒体凋亡途径诱导OCs和OPCs发生凋亡。