文章分为以下几部分进行论述：　　第一部分 慢病毒介导的高表达ACE2的MSC细胞株的构建及鉴定　　目的:构建慢病毒介导的长期稳定高表达血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme2，ACE2)的小鼠骨髓来源的间充质干细胞(Mesenchymalstem cells，MSC)细胞株。　　方法:(1)采用贴壁法原代分离培养C57BL/6小鼠骨髓来源的MSC，并通过倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞学检测表面标志物和诱导成脂、成骨分化对其进行鉴定。(2)采用第三代自身灭活的免疫缺陷病毒作为慢病毒表达载体骨架，人翻译延长因子1A作为启动子，利用Gateway克隆技术通过BP重组反应构建pDown-mACE2，然后通过LR重组反应将ACE2基因克隆人慢病毒表达载体中获得高表达ACE2的慢病毒表达载体pLV.EX3d.P/neo-EF1A＞ mACE2＞IRES/eGFP，与ACE2基因共表达的增强型的绿色荧光蛋白(eGFP)作为报告基因，表达载体在另外三个辅助质粒:pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5辅助下在293FT细胞中进行包装，获得滴度较高的慢病毒，将重组慢病毒转染4-7代的MSC，用G418进行抗药基因塞选纯化，从而获得纯度较高的携带了eGFP和ACE2的MSC(MSC-ACE2)及仅携带了eGFP的空白对照MSC(MSC-GFP)，通过荧光显微镜及流式细胞仪检测MSC在转染后以及稳定传代30代以上后的eGFP表达阳性率以评估MSC的转染效率。通过逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法和Western blotting法检测转染后MSC的ACE2基因和蛋白表达水平，用ELISA法检测转染后MSC培养基中可溶性ACE2蛋白的表达。(3)通过体外诱导MSC、MSC-GFP、MSC-ACE2向脂肪细胞、骨细胞分化，评估基因转染对MSC多项分化潜能的影响;MTT法比较MSC、MSC-GFP、MSC-ACE2增殖能力，评估基因转染对MSC增殖的影响; Transwell小室迁移实验检测MSC、MSC-GFP、MSC-ACE2的迁移能力，评估基因转染对MSC迁移能力的影响。　　结果:(1)成功分离培养原代C57BL/6小鼠骨髓来源的MSC，细胞呈长梭形，极性生长，生长旺盛;流式细胞学检测MSC表形，MSC表达Sca-1、CD29、CD34、CD44，不表达CD117;多项分化潜能检测MSC可体外诱导分化为脂肪细胞和骨细胞。(2)慢病毒介导的高表达ACE2的MSC，荧光显微镜观察转染后转染效率高达95％以上，稳定传代培养30代后，流式细胞仪检查其转染效率仍高达86％-94.3％;与未转染的MSC相比，ACE2高表达的MSC其ACE2 mRNA水平、膜型ACE2蛋白及可溶性ACE2蛋白水平均显著增高，分别是未转染细胞的4倍、1.9倍和2.6倍（P值均＜0.05）。(3)ACE2基因转染前后，MSC成骨成脂分化、增殖、迁移能力均无显著差异。　　结论:慢病毒载体介导的ACE2基因转染能高效转染原代骨髓来源的MSC，转染后的MSC可稳定高表达ACE2蛋白，并且其成骨和成脂分化、增殖和迁移能力无明显影响。　　第二部分 高表达ACE2的MSC对脂多糖诱导的肺微血管内皮细胞损伤的保护作用的研究　　目的:明确高表达ACE2的MSC(MSC-ACE2)对LPS损伤后肺微血管内皮细胞(EC)活化的肾素血管紧张素系统(RAS)的抑制效应及其对损伤EC的保护作用。　　方法:(1)在体外用100ng/ml LPS干预贴壁生长的EC，于0h、2h、4h、6h、12h、24h观察其对EC衰老、内皮通透性的影响，选择恰当的时间点以建立LPS诱导的EC损伤模型。(2)将损伤的EC与不同细胞进行间接共培养以评估MSC-ACE2对损伤EC的修复效应及机制，分为以下五组:EC组、EC+LPS组、EC+LPS+MSC组、EC+LPS+MSC-GFP组和EC+LPS+MSC-ACE2组。(3) ELISA法检测培养基中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素1-7(Ang1-7)的水平，qRT-PCR检测EC表面血管紧张素1型受体(AT1R)和AT2R的表达以评估MSC-ACE2对EC局部RAS的影响。通过流式细胞仪检测EC凋亡、细胞衰老检测以评估MSC-ACE2对EC活力的影响;通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测EC的ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6的mRNA水平和ELISA法检测培养基中TNF-α和IL-6蛋白水平的表达以评估MSC-ACE2对EC炎症介质表达的影响;通过葡聚糖渗漏实验检测EC通透性、Western blotting检测EC粘附连接VE-cadherin的表达、ELISA法检测培养基中血管内皮生长因子(VEGF)的表达以评估MSC-ACE2对EC通透性的影响及其可能的机制;　　结果:(1)LPS刺激EC后可以导致EC衰老比例和EC通透性逐渐增加，并呈时间依赖性，与0h点相比，LPS干预4h后细胞衰老比例增加明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)，LPS干预6h后内皮通透性增高显著，差异具有统计学意义（P＜0.05），本研究中采用LPS干预6h来建立EC损伤模型。(2) MSC-ACE2可显著抑制LPS损伤后EC活化的RAS。与LPS损伤组比较，MSC-ACE2组培养基中AngⅡ的水平显著降低，而AngⅡ的降解产物Ang1-7水平显著增加，对EC表达AT1R和AT2R mRNA的表达无明显影响;而MSC和MSC-GFP组对上诉指标均无显著影响。(3) MSC-ACE2可较MSC和MSC-GFP更好的减少LPS损伤后EC的早期凋亡[(6.93±0.53) vs.(13.91±0.77)&(13.38±1.59)，P＜0.05]和细胞衰老[(4.37±0.54) vs.(7.85±0.33)&(7.16±0.16)，P＜0.05]。(4)MSC-ACE2可抑制LPS损伤的EC炎症介质的产生。MSC和MSC-GFP与损伤EC共培养后，仅可降低损伤EC表面ICAM-1 mRNA的表达，而MSC-ACE2组EC粘附分子ICAM-1、VCAM-1和促炎因子TNF-α、IL-6的mRNA水平和TNF-α、IL-6的蛋白水平均显著降低（P＜0.05）。(5) MSC-ACE2可显著改善LPS损伤EC的屏障功能。葡聚糖渗漏实验结果显示MSC-ACE2可降低LPS损伤后EC通透性至正常水平，Western blotting法检测发现MSC-ACE2组EC粘附连接VE-cadherin的表达水平显著增加，恢复正常，且培养基中VEGF表达水平也显著降低至正常水平;MSC和MSC-GFP组对上诉指标均有改善的趋势，但差异无统计学意义。　　结论:高表达ACE2的MSC可以抑制LPS损伤后肺微血管内皮细胞局部RAS的活化，并通过降低损伤内皮的凋亡和衰老、抑制损伤内皮炎症介质的表达、恢复内皮细胞功能。　　第三部分 高表达ACE2的MSC移植对ALI的修复作用的研究　　目的:明确高表达ACE2的MSC移植入急性肺损伤(ALI)小鼠体内可靶向抑制肺组织RAS的活化，修复微血管内皮细胞、抑制肺组织炎症，从而促进肺损伤修复。　　方法:野生型(WT)和ACE2基因敲除(ACE2-/y)的C57BL/6小鼠随机分为Control组(NS+PBS),ALI组(LPS+PBS), MSC-GFP组(LPS+MSC-GFP), ACE2组(LPS+MSC-ACE2)，气道内滴入LPS复制ALI小鼠模型，造模4h后按分组给予不同处理，24h和72h后(1)近红外活体、离体器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胰腺）成像及肺组织荧光镜检评价MSC-ACE2细胞在损伤肺组织内的靶向归巢作用。(2)处死小鼠留取肺组织，Western blotting法和ELISA法检测肺组织、肝脏、脾脏和血浆中ACE2蛋白的表达、ELISA法检测肺组织内血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、Ang1-7的水平，证实ALI发生以后，肺组织局部肾素-血管紧张素系统(RAS)激活，并明确高表达ACE2的MSC移植是否能在损伤肺组织局部高表达ACE2蛋白及其对局部血管紧张素的调节作用。(3)计算肺湿重/体重比评价肺水肿程度;伊文思蓝漏出实验评价肺微血管内皮通透性;电镜观察肺微血管内皮细胞超微结构及细胞间连接以评价肺微血管内皮细胞的损伤程度;Western blotting检测肺组织内iNOS、eNOS的水平评价肺血管内皮细胞的合成功能，从而综合评价高表达ACE2的MSC对ALI小鼠肺微血管内皮细胞的修复作用。(4)HE染色行组织病理学检查并进行肺损伤评分以评价肺损伤严重程度;留取肺泡灌洗液(BALF)，计数肺泡灌洗液中有核细胞总数和瑞氏染色进行中性粒细胞分类计数评价炎症细胞的浸润程度;ELISA法检测肺组织匀浆中IL-1β、IL-6、IL-10的浓度评价肺部炎症反应的强度，从而综合评价高表达ACE2的MSC对ALI小鼠肺组织失控炎症反应的抑制效应和肺损伤修复作用。　　结果:(1)活体及离体器官成像结果显示，高表达ACE2的MSC移植后30min在肺组织内即可见明显的荧光信号，在24h达到高峰，72h有所降低;在72h肺组织荧光镜检也可见较多表达绿色荧光蛋白的MSC，心脏、肾脏、胰腺、肠道未见明显荧光信号积聚，肝脏和脾脏随着时间点延长荧光信号积聚有所增强。(2)高表达ACE2的MSC归巢至损伤肺组织后，肺组织内ACE2蛋白水平较MSC-GFP显著增加，肝脏和脾脏组织中ACE2蛋白在移植后72h有增加趋势，而血清中ACE2蛋白水平较前无明显变化，;ALI发生后，损伤肺组织内AngⅡ的水平较对照组显著升高，Ang1-7的水平明显降低，AngⅡ的水平在ACE2-/y的ALI小鼠比野生型ALI小鼠增加更为显著，MSC-GFP组AngⅡ水平有所降低，而ACE2高表达MSC治疗组AngⅡ的水平下降较MSC-GFP组更加显著，且Ang1-7的水平较ALI组和MSC-GFP治疗组增加更显著。(3)高表达ACE2的MSC移植可减轻LPS诱导的WT和ACE2-/y的ALI小鼠肺微血管内皮细胞损伤。MSC-ACE2组与MSC-GFP组相比较能更显著的减少肺湿重/体重比、降低肺微血管内皮对伊文思蓝的通透性、恢复肺微血管内皮细胞超微结构及细胞间连接;不仅如此，MSC-ACE2可显著改善肺微血管内皮合成iNOS、eNOS的功能。(4)高表达ACE2的MSC移植可减轻LPS诱导的WT和ACE2-/y的ALI小鼠肺病理损伤，抑制肺组织炎症反应。MSC-ACE2治疗与MSC-GFP治疗相比可显著减轻肺损伤、降低肺损伤评分、BALF中有核细胞总数、中性粒细胞数，并且能更有效的降低肺组织内促炎介质IL-1β、IL-6水平，并增加抗炎介质IL-10水平。　　结论:高表达ACE2的MSC移植可靶向抑制ALI肺组织局部活化的RAS，较未高表达ACE2的MSC能更好的促进肺微血管内皮细胞屏障功能和合成功能的恢复，抑制肺部的炎症反应，促进肺损伤的修复。为ALI肺微血管内皮修复和局部炎症抑制开辟新的防治途径。