论文部分内容阅读
目的肿瘤免疫治疗是继手术、化疗和放疗后的肿瘤治疗新策略。作为肿瘤微环境中数量最多的免疫细胞,M2型巨噬细胞可大量分泌免疫抑制的细胞因子如IL-4、IL-10等,抑制T细胞介导的免疫反应并降低ROS和NO的生成,从而抑制机体的抗肿瘤免疫应答,诱导肿瘤新生血管的形成并促进肿瘤的侵袭转移,在肿瘤的增殖和转移过程中发挥着至关重要的作用。已有研究表明,肿瘤相关巨噬细胞具有高度的可塑性,M2型巨噬细胞在一定条件下可被极化为抗肿瘤的M1型巨噬细胞。因此,将促肿瘤的M2型巨噬细胞极化为抗肿瘤的M1型,可逆转M2型巨噬细胞引起的免疫抑制的肿瘤微环境,从而达到特定的肿瘤免疫治疗作用。为提高对M2型巨噬细胞的极化作用,降低循环系统中其它巨噬细胞对递药系统的摄取与清除,并减少对M1型巨噬细胞的影响,本论文以M2型巨噬细胞表面高表达的CD206（甘露糖受体）为靶标,以具有M2型巨噬细胞极化作用的唑来膦酸为模型药物,设计构建了特异性靶向M2型巨噬细胞的纳米递药系统,以期通过靶向M2型巨噬细胞并将其极化为抑制肿瘤生长的M1型巨噬细胞,消除肿瘤微环境中M2型巨噬细胞免疫抑制作用的同时,激活机体的抗肿瘤免疫应答以抑制肿瘤的生长,为肿瘤免疫治疗中递药系统的构建提供新的思路。方法1、以甘露糖为靶向基团,唑来膦酸为模型药物,DOPA、胆固醇、DOTAP、DSPE-PEG2000-Ma为载体材料,采用反相微乳法制备甘露糖残基修饰的负载唑来膦酸的M2型巨噬细胞靶向纳米粒M2-TNPs。采用上述同样方法,以不含靶向基团的载体材料DSPE-PEG2000代替DSPE-PEG2000-Ma制得非靶向纳米粒Non-TNPs。使用纳米激光粒度测定仪对M2-TNPs和Non-TNPs的粒径和zeta电位进行测定,并对其稳定性进行研究;采用透射电镜和扫描电镜对M2-TNPs进行形态学表征;通过紫外-可见光分光光度计测定M2-TNPs和Non-TNPs中唑来膦酸的载药量和包封率。2、采用荧光显微镜和荧光酶标仪测定骨髓源巨噬细胞、M1和M2型巨噬细胞对NBD荧光素标记的M2-TNPs和Non-TNPs的摄取情况,对其靶向特性进行评价,并通过甘露聚糖竞争抑制实验进一步评价其M2型巨噬细胞靶向性;采用CCK-8细胞活力测定实验对游离唑来膦酸、Non-TNPs和M2-TNPs的巨噬细胞毒性进行评价;采用流式细胞术、Western Blot及ELISA实验测定M2-TNPs的免疫调节作用,并与游离唑来膦酸和Non-TNPs比较,评价M2-TNPs对M2型巨噬细胞的极化能力;使用Transwell建立黑色素瘤细胞B16-F10与M2型巨噬细胞共培养模型,体外验证M2-TNPs通过极化M2型巨噬细胞为M1型巨噬细胞的抗肿瘤活性,并对竞争性配体甘露聚糖加入后的肿瘤细胞抑制率变化进行测定,进一步验证其M2型巨噬细胞靶向性;使用Transwell建立黑色素瘤细胞B16-F10与T细胞的共培养模型,体外验证M2-TNPs通过极化M2型巨噬细胞,促进T细胞的活化与增值,进而抑制肿瘤细胞生长的活性。3、采用C57BL/6小鼠建立黑色素瘤B16-F10皮下移植瘤模型,给药后与游离唑来膦酸和Non-TNPs比较,评价M2-TNPs的体内肿瘤免疫治疗活性,并对其与化疗药物达卡巴嗪的联合治疗效果进行考察;采用TUNEL法测定小鼠肿瘤细胞凋亡情况,H&E染色法进一步考察M2-TNPs的抗肿瘤效果;采用H&E染色法检测M2-TNPs的体内安全性;采用免疫荧光染色法考察M2-TNPs的体内靶向递送特性;采用流式细胞术、Western Blot、免疫荧光染色及ELISA实验研究M2-TNPs的体内免疫调节作用及其机制。结果1、采用反相微乳法制备得到了负载唑来膦酸的M2型巨噬细胞靶向纳米粒M2-TNPs。Delsa TMM Nano C纳米激光粒度测定仪结果显示,M2-TNPs的粒径约为140nm,而且其粒径在28天内没有明显变化,具有良好的稳定性。透射电镜和扫描电镜结果显示,M2-TNPs形态均一,呈类球形。紫外-可见光分光光度计测定结果表明,M2-TNPs对唑来膦酸的载药量和包封率分别为9.4±0.9%和52.0±5.0%。2、体外细胞摄取测定结果显示,当与骨髓源巨噬细胞及M1巨噬细胞共孵育时,其对Non-TNPs和M2-TNPs的摄取均较少,但与M2型巨噬细胞共孵育时,其对M2-TNPs的摄取量明显增多,而对Non-TNPs的摄取量仍然较少。当加入竞争性配体甘露聚糖后,M2-TNPs在M2型巨噬细胞中的摄取被抑制,而Non-TNPs的摄取情况则不受影响。上述结果证实甘露糖残基的修饰可提高M2-TNPs在M2型巨噬细胞中的摄取入胞,具有靶向M2型巨噬细胞的特性。细胞活力测定实验、流式细胞术、Western Blot及ELISA实验结果表明,在不影响M1和M2型巨噬细胞活性的给药浓度下,游离唑来膦酸、M2-TNPs及Non-TNPs均能极化M2型巨噬细胞为M1型,使得M2型巨噬细胞相关免疫抑制细胞因子Arg-1、IL-10表达量下降的同时,M1型巨噬细胞相关细胞因子iNOS、TNF-α的表达上升,从而发挥其抗肿瘤作用。与游离唑来膦酸和Non-TNPs相比,M2-TNPs展示出更强的M2型巨噬细胞极化能力。CCK-8细胞活力测定结果显示,在免疫治疗浓度下,游离唑来膦酸、Non-TNPs及M2-TNPs对肿瘤细胞B16-F10的增殖均无明显的直接抑制作用。当在共培养模型的M2型巨噬细胞一侧加入游离唑来膦酸、Non-TNPs及M2-TNPs后,B16-F10细胞存活率明显下降,表明其抗肿瘤作用与诱导M2型巨噬细胞极化的免疫激活作用有关。而且,与游离唑来膦酸和Non-TNPs相比,M2-TNPs的抗肿瘤作用最强。此外,在加入甘露糖受体的竞争性配体甘露聚糖后,M2-TNPs的抗肿瘤作用明显下降,而游离唑来膦酸和Non-TNPs则不受影响,进一步证明M2-TNPs可通过甘露糖受体介导入胞,具有M2型巨噬细胞靶向性。当在B16-F10与T细胞的共培养模型中加入M2型巨噬细胞给药上清液后,与对照组相比,加入游离唑来膦酸、Non-TNPs及M2-TNPs上清液组B16-F10的细胞存活率均明显下降。流式细胞术测定结果显示,游离唑来膦酸、Non-TNPs及M2-TNPs上清液均能够有效促进效应T细胞的活化与增值,表明游离唑来膦酸、Non-TNPs及M2-TNPs可通过极化M2型巨噬细胞,有效促进效应T细胞的活化与增殖,激活T细胞介导的抗肿瘤免疫应答,从而发挥肿瘤免疫治疗作用。而且,与游离唑来膦酸和Non-TNPs相比,M2-TNPs由于能够更有效地极化M2型巨噬细胞,具有最强的抗肿瘤活性。3、B16-F10荷瘤小鼠的体内抗肿瘤实验结果表明,与模型对照组相比,靶向纳米粒M2-TNPs能够有效抑制肿瘤的生长,肿瘤抑制率为45.2%,而游离唑来膦酸和Non-TNPs组的肿瘤抑制率分别为11.7%及6.9%,抗肿瘤效果相对较差。肿瘤组织的TUNEL和H&E染色结果表明,与游离唑来膦酸和Non-TNPs相比,M2-TNPs给药组诱导肿瘤细胞凋亡作用最强,肿瘤细胞数量明显减少,抗肿瘤效果最佳。M2-TNPs与化疗药物达卡巴嗪联合用药结果显示,肿瘤细胞凋亡数量明显提高,其肿瘤抑制率高达93.2%,表现出显著的免疫治疗与化学治疗协同增效作用。小鼠各脏器的H&E结果显示,靶向载药纳米粒M2-TNPs具有良好的生物相容性。肿瘤组织免疫荧光染色结果显示,与Non-TNPs相比,M2-TNPs能更好地富集于肿瘤部位,且与甘露糖受体显示出更高水平的共定位。流式细胞术结果显示,M2-TNPs组小鼠肿瘤组织M2型巨噬细胞数量下降的同时,M1型巨噬细胞数量明显增加,具有明确的M2型巨噬细胞极化能力。Western Blot、免疫荧光染色结果显示,M2-TNPs给药后,肿瘤组织中M1型巨噬细胞标志物CD80表达量增加,M2型巨噬细胞标志物CD206的表达量明显减少,这与M2型巨噬细胞极化为M1表型有关,该变化与流式细胞术结果一致。ELISA实验结果显示,与游离唑来膦酸和Non-TNPs组相比,M2-TNPs给药组M1型巨噬细胞相关细胞因子CD80、iNOS和TNF-α表达量明显增加,M2型巨噬细胞相关细胞因子CD206、Arg-1和IL-10的表达量明显下降,表明M2-TNPs极化M2型巨噬细胞能力最强。流式细胞术测定结果显示,与模型对照组、游离唑来膦酸及Non-TNPs组相比,M2-TNPs组CD8+T细胞的数量及其活化标志物IFN-γ的分泌量明显提高。Ki-67细胞增殖检测结果显示,M2-TNPs能够有效促进效应T细胞的增殖,表明M2-TNPs在极化M2型巨噬细胞为抗肿瘤的M1型巨噬细胞的同时,可有效促进效应T细胞的活化与增殖,激活T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。结论本论文以M2型巨噬细胞表面CD206为靶标,以唑来膦酸为模型药物,利用反相微乳法制备得到负载唑来膦酸的M2型巨噬细胞靶向纳米递药系统M2-TNPs。M2-TNPs能够特异性靶向肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞,并将其极化为抗肿瘤的M1型巨噬细胞,在消除M2型巨噬细胞免疫抑制作用的同时,激活机体的抗肿瘤免疫应答,从而展现出良好的体内外抗肿瘤活性。通过进一步的研究,有望为恶性肿瘤的免疫治疗提供高效的药物靶向递送系统。