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随着分子生物学的发展，人类对于DNA重组技术的认识逐渐成熟，肿瘤基因治疗作为治疗肿瘤的新手段应运而生。在肿瘤基因治疗中，载体以及运输细胞的选择尤为关键。我室一直致力于安全，高效的非病毒载体的研究与开发，在前期研究中已经成功构建了针对肿瘤基因治疗的载体:pHrneo-IL24。在靶细胞的选择上，MSCs具有向肿瘤位置迁移和趋近的能力，并且易于分离，可分化为多种细胞，有报道表明MSCs已应用于肿瘤治疗的临床前试验。MSCs的靶向基因修饰可进一步促进其在肿瘤基因治疗中的疗效，但MSCs的基因修饰一直是个技术难题，靶向基因编辑技术——核酸工程酶TALEN的出现为突破此难题提供了良好的工具。因此，本研究拟结合TALENickases（我室已建立的TALEN高效突变体），利用携带IL-24的核糖体基因区靶向载体pHrneo-IL24对MSCs进行基因打靶，以期得到稳定表达有生物学活性IL-24蛋白的定点整合克隆。 目的:使用pHrneo-IL24载体系统联合TALENickases打靶MSCs，以期得到稳定表达IL-24的MSC细胞株。 方法:1.MSCs的分离与培养:从骨髓标本中分离骨髓中的单核细胞，再用贴壁培养分离出骨髓间充质干细胞(MSCs)。2.流式鉴定扩大培养的MSCs表面标志物。3.将TALENickases以及pHrneo-IL24质粒通过核转，共转染至MSCs，镜下通过观察融合的GFP蛋白表达，分析转染效率。4、转染后细胞分两线接种，一线加入G418筛选定点整合克隆，另一线直接扩增培养。5.抽提打靶后细胞gDNA，定点整合PCR鉴定rDNA区整合细胞。6.收集打靶后细胞上清，ELISA检测细胞克隆IL-24蛋白的表达量。 结果:1.从骨髓标本中分离出的MSCs呈短梭形，形态规整，数次传代后，呈成纤维状，流式结果显示符合MSCs的各项表面标志物表达;2.核转后的MSCs镜下可见绿色荧光表达，G418筛选后的细胞大量死亡，未得到定点整合的单克隆细胞。3.扩增未加G418筛选的转染后MSCs，抽提gDNA后，通过定点整合PCR检测到混合细胞中存在一定量的定点整合细胞。4.收集混合细胞上清，通过ELISA可检测到17.459 ng/ml的IL-24蛋白表达。 结论:成功分离并得到MSCs，初步验证联合TALENickases以及pHrneo-IL24载体能将IL-24表达框靶入到MSCs核糖体基因区，并分泌IL-24蛋白。