研究背景：哮喘是由细胞因子参与调节的以嗜酸性粒细胞（EOS）浸润为主的气道慢性炎症性疾病。活化的EOS 可释放主要碱性蛋白（MBP）等多种炎性介质，引起局部炎症反应，激发气道高反应性，但以MBP 为主的阳离子蛋白引起气道炎症的机制尚不清楚。资料表明气道上皮细胞中MBP 可竞争抑制精氨酸进入细胞内，支气管哮喘患者血中精氨酸水平以及它的生物利用度均低于非哮喘患者。研究表明细胞因子可调控炎症反应，在哮喘气道炎症产生和持续过程中发挥重要作用。但在气道上皮细胞中精氨酸对细胞因子的调控及其具体机制尚不清楚。　　 目的：研究精氨酸和阳离子蛋白在前炎症因子诱导下，促炎症介质在肺上皮细胞中的表达及其机制，以阐明精氨酸和阳离子蛋白在支气管哮喘发病机制中所起的作用。　　 方法：⑴哮喘气道炎症微环境细胞模型的建立为模仿哮喘气道炎症微环境，用前炎症因子肿瘤坏死因子（TNF-α）和脂多糖（LPS）预先将气道上皮细胞激活，制成哮喘气道上皮细胞模型。并且在加入刺激物之前，用不含血清的RPMI 1640 再洗1 次，以去除内源性细胞因子和排除血清的影响，不加任何刺激物的细胞作为阴性对照。⑵IL-6和IL-8 水平及IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的测定收集上述细胞培养的上清液，采用酶联免疫吸附法（ELISA）夹心法测定其中IL-6和IL-8 水平。mRNA测定运用TriZol 提取NCI-H292细胞总RNA，后用斑点印迹法，特殊32 P 标记探针的杂交法检测IL-6，IL-8和GAPDH mRNA的水平，斑点以磷光计量化，并以看家基因GAPDH的mRNA表达水平校正。⑶阳离子蛋白抑制左旋精氨酸进入细胞内能力的测定NCI-H292细胞或NHBE细胞过夜培养，Hank’s 平衡溶解液（HBSS）清洗后，然后在含有不同浓度的多聚左旋精氨酸或MBP的HBSS 中培养24 小时后，加入14 C标记的左旋精氨酸，最后溶解细胞，采用放射免疫分析法（RIA）测定细胞内14 C标记的左旋精氨酸，以不含阳离子蛋白作为对照。⑷IL-6 mRNA和IL-8 mRNA 降解的测定NCI-H292细胞在常规培养基中过夜培养，按照实验要求加入刺激物和反应物，细胞培养2 小时后，以放线菌素C1 终止转录，在0，40，80 分钟时测定剩余IL-6,IL-8和GAPDH mRNA的水平，同样以看家基因GAPDH的mRNA表达水平校正。⑸磷酸钙共沉淀法转染NCI-H292细胞首先构建含有IL-6和IL-8基因启动子区域的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因的载体，当NCI-H292细胞生长到70％时，将上述载体转染到NCI-H292细胞，培养24 小时后按照实验要求加入各种刺激物，18 小时收获转染细胞，裂解细胞，用CAT ELISA 试剂盒检测各组CAT 蛋白的含量。⑹统计学处理所有参数及其比较均采用SPSS11.5软件，实验数据以均数±标准误（SEM）表示。两组间比较采用t 检验分析；多样本比较先采用单因素方差分析，两两比较当方差齐时采用LSD 方法，方差不齐时采用Dunnett’s T3 方法；相关分析采用Pearson 相关分析，差异比较P ≤0.05考虑有统计学意义。　　 结果：①不同培养液对NCI-H292细胞IL-6和IL-8表达的影响：因为NCI-H292细胞常规培养基中（RPMI-1640）含有1mM 左旋精氨酸，为了解不同培养基对IL-6和IL-8表达的影响，比较NCI-H292细胞在不含精氨酸的最低需要培养基（MEM-A-）与含1mM 左旋精氨酸的MEM （MEM-A+）和RPMI-1640 三种不同培养液中，LPS或TNF-α共刺激后的IL-6和IL-8的表达，H292细胞在RPMI-1640和MEM-A+中产生的IL-6 或 IL-8 水平均无明显差异（所有P>0.05，IL-6和 IL-8），说明左旋精氨酸相同浓度下，RPMI-1640和MEM 两种不同培养基的其他成分对NCI-H292细胞的IL-6和IL-8的表达无显著的影响。另外，在MEM-A-中较MEM-A+产生更多的IL-6或IL-8，且与TNF-α的浓度成正相关（r=0.604，P=0.001；r=0.730，P<0.001，IL-6和IL-8），但与LPS 无明显相关（r=0.017，P=0.929；r=0.218，P=0.246，IL-6和 IL-8）。②不同剂量左旋精氨酸对NCI-H292细胞IL-6和IL-8表达的影响：左旋精氨酸在0 到1mM之间，随着左旋精氨酸浓度的上升，IL-6的水平反而下降，两者呈负相关关系（r=－0.513；P=0.03），低水平左旋精氨酸也升高NCI-H292细胞IL-8的水平，然而我们没有发现左旋精氨酸和IL-8 呈负相关关系。③低水平的左旋精氨酸可使支气管原代上皮细胞 （NHBE）的IL-8表达增高：与MEM-A+相比较，在MEM-A-培养基中不加刺激物和LPS 组，NHBE细胞产生的IL-8 显著高于相应的MEM-A+培养基组（P=0.001和P=0.003），但对于TNF-α刺激的NHBE细胞的IL-8 在两者之间无明显差异（P=0.11）。④多聚左旋精氨酸在NCI-H292细胞中的作用：多聚左旋精氨酸(≥10 μg/ml)显著抑制左旋精氨酸进入NCI-H292细胞内（P<0.001），多聚左旋精氨酸与LPS 联合作用显著升高IL-6和IL-8，特别是当多聚左旋精氨酸为5μg/ml时最显著。IL-6 与多聚左旋精氨酸抑制左旋精氨酸的再摄取呈负相关，这种作用并不受LPS的影响（r=－0.662，P=0.001；r=－0.598，P<0.01）。IL-8的表达略不同于IL-6，这种相关性与多聚左旋精氨酸的浓度密切联系，当多聚左旋精氨酸为0 至5μg/ml时，两者同IL-6 呈负相关（r=－0.895，P<0.001）；而当浓度为5至80 μg/ml时，则呈正相关（r=0.896，P<0.001）。此外，H292细胞在多聚左旋精氨酸和LPS 共培养时诱导IL-6和IL-8的水平与LPS的剂量呈效应关系，然而，多聚左旋精氨酸与TNF-α之间未见协同作用。⑤MBP 在NCI-H292细胞中的作用：一定浓度的MBP 同样抑制左旋精氨酸的再摄取，并且与MBP的浓度呈依赖性（r=－0.737，P<0.001）。MBP 与多聚左旋精氨酸作用类似，MBP 与LPS 共同作用显著升高IL-6和IL-8；不同的是，只有LPS不存在于培养基中，IL-6和IL-8的水平与MBP 抑制左旋精氨酸的再摄取呈负相关（r=－0.752，P<0.001；r=－0.784，P<0.001），而当LPS 存在于培养基中时，MBP抑制左旋精氨酸的再摄取能力与IL-6和IL-8的水平无相关性（r=0.083，P=0.744；r=－0.080，P=0.752）。⑥多聚左旋精氨酸在NHBE细胞中的作用：一定浓度的多聚左旋精氨酸(≥10μg/ml)同样阻止左旋精氨酸进入NHBE细胞内（P<0.001），TNF-α（t=7.264，P<0.0001；t=6.002，P<0.0001），而不是LPS 明显协同多聚左旋精氨酸释放IL-6和IL-8 （t=－1.693，P=0.098；t=－0.738，P=0.464）。⑦多聚左旋精氨酸对LPS 诱导的IL-6和IL-8 mRNA的水平的影响与单一LPS 相比较，NCI-H292细胞常规培养基中加入多聚左旋精氨酸和LPS 后，可显著增高NCI-H292细胞在培养0h、1h、2h、4h、6h和24h的IL-6 mRNA和IL-8mRNA的水平（所有P<0.05，IL-6和 IL-8），特别是在共培养2h时有一显著高峰（P<0.0001，P<0.0001；IL-6和 IL-8）。⑧多聚左旋精氨酸对IL-6和IL-8 启动子转染的NCI-H292细胞的CAT 水平的影响多聚左旋精氨酸与LPS 共培养组的IL-6-CAT和IL-8-CAT 均显著高于LPS和多聚左旋精氨酸组（P<0.0001，P<0.0001；P<0.05，P<0.05，IL-6和 IL-8）。⑨多聚左旋精氨酸作用下的LPS 诱导的IL-6和IL-8 mRNA的降解NCI-H292细胞在多聚左旋精氨酸和LPS 共同诱导下的IL-6 mRNA和IL-8mRNA的降解与单一LPS 无明显差异（P>0.05，P>0.05；IL-6和IL-8）。　　 结论：⑴一定浓度的左旋精氨酸抑制NCI-H292细胞和支气管原代上皮细胞促炎症介质的释放；⑵多聚左旋精氨酸不但抑制左旋精氨酸进入NCI-H292细胞和支气管原代上皮细胞内，而且可在LPS 刺激后升高IL-6和IL-8的表达，两者之间密切相关，MBP与多聚左旋精氨酸作用类似；⑶多聚左旋精氨酸促进LPS 诱导NCI-H292细胞IL-6和IL-8 生成增多的机制可能在于转录活性增加，并非由于IL-6 mRNA和IL-8 mRNA 降解减少。