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结核病是由结核分枝杆菌感染引发的一种传染病。目前由于新型耐多药结核病的出现,传统的抗结核病药物如异烟肼和利福平等在治疗过程中遇到了困难,使得结核病疫情在全世界范围内有扩大的趋势,因此,研究抗病机理不同作用靶点不同的抗结核病药物显得尤为关键。Intein是一段插入序列,在蛋白质水平下具有自剪接功能。在结核分枝杆菌中有三类重要的酶RecA、DnaB和SufB是通过intein自剪接得到的,而对intein自剪接功能的抑制可以阻断活性RecA、DnaB和SufB的生成,进而影响结核杆菌的生长繁殖。本论文主要依据RecAintein生物学功能以及在结核分枝杆菌中的发挥的重要作用,利用荧光光谱手段检测了五种简单的钯(Ⅱ)配合物对RecAintein的剪接抑制作用,并对intein突变体△△Ihh-CM和五种钯(Ⅱ)配合物的相互作用做了简单的分析。
第一章第一小节通过文献调研对本篇论文的研究意义、研究背景、研究现状以及研究手段等方面做了简单介绍。第二小节通过文献综述,分别从蛋白质内含子intein的蛋白剪接作用、命名规则、保守基序、剪接机理以及intein的药物靶点的应用方面做了简单的阐述。第三小节介绍了实验中所使用的研究方法荧光光谱。
第二章利用GFP-intein融合蛋白剪接可以生成绿色荧光蛋白GFP的过程,研究了Pd(bipy)Cl2、Pd(phen)Cl2、trans-Pd(NH3)2Cl2、cis-Pd(NH3)2Cl2以及[Pd(dien)Cl]Cl五种钯(Ⅱ)配合物对intein自剪接活性的抑制作用。实验结果表明,五种钯配合物均对intein的自剪接有抑制作用,且trans-Pd(NH3)2Cl2的抑制活性最高,IC50值为30μM,由于单齿配合物[Pd(dien)Cl]Cl钯上只有一个氯有水解活性,对剪接相关的氨基酸封闭作用不大,因此其intein自剪接的抑制活性小于其他四个二齿配体的钯配合物。此外,通过已有文献报道的关于铂配合物结构对intein自剪接抑制的实验结果对比分析来看,钯配合物对intein剪接的抑制过程和机理可能与铂配合物存在着差别。
第三章通过荧光对△△Ihh-CM与钯配合物的相互结合做了简单分析。首先检测了GSH和EDTA对trans-Pd(NH3)2Cl2的intein剪接抑制作用的影响,实验结果发现当trans-Pd(NH3)2Cl2阻断GFP-intein剪接生成GFP后,在实验体系中加入GSH可以使荧光恢复,说明GFP-intein进行正常的剪接并生成了荧光基团GFP,而EDTA不能使这种剪接抑制恢复,该结果反映出钯配合物很可能与半胱氨酸残基结合,而半胱氨酸残基活性的丧失是阻断了intein的自剪接过程的重要原因。此外,不同浓度的钯配合物与intein相互作用实验证实了intein与钯配合物的结合并不是剪接抑制的唯一因素,同时,实验结果反映了intein上可能存在多个钯结合位点。在研究钯配合物与intein的反应动力学实验中,我们得到钯配合物上的配体影响钯配合物与intein作用的速率,即配体越大,反应速率越慢。