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微藻作为具有光合作用的单细胞生物,贡献了全球40%的初级生产力。微藻的光合作用效率高、易于培养、生物量高、不与农田争地、易于遗传改造,广泛应用于能源、医药、食品等领域中。三角褐指藻是一种代表性单细胞海洋硅藻,含有较高的脂质含量和多不饱和脂肪酸成分,基因组已经测序,并可易于遗传转化。三角褐指藻不仅保留了微藻常见的特点,而且含有较高的脂质含量和多不饱和脂肪酸组成。此外,它可以通过基因工程方式获得高产脂质和多不饱和脂肪酸的工程藻株。油体作为微藻的油脂储存细胞器,参与微藻脂质合成过程,包括油体膜合成、脂质合成及降解、脂质流动、信号传导等多种生物过程。对微藻油体的蛋白组成和功能的研究可以进一步厘清脂质累积的机制,为微藻能源产业化过程奠定坚实的基础。本研究中,我们通过对三角褐指藻中脂质合成途径的潜在重要节点开展了基因功能的研究,通过细胞分子生物学手段结合生理生化指标的测定,获得了如下一系列研究结果:1、三角褐指藻甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)生物合成途径中,鉴定了一个1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(1?acyl?sn?glycerol?3?phosphate acyltransferase,AGPAT1),发现AGPAT1含有四个保守的酰基转移酶基序I-IV。免疫电镜结果显示AGPAT1定位于叶绿体膜上。过表达AGPAT1降低了总糖含量和可溶性蛋白含量,提高了脂质含量。AGPAT1可以协调TAG中其他关键基因的表达,此外,AGPAT1改变了脂肪酸组分,多不饱和脂肪酸也有所提高。我们不仅观察到细胞质中油体增大,超微结构显示叶绿体中也形成了许多含有TAG的质体小球。结果表明过表达AGPAT1可以提高TAG含量,也揭示了硅藻中新颖的叶绿体TAG合成途径。2、鉴于我们前期发现的甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol?3?phosphate acyltransferase,GPAT1)和AGPAT1在三角褐指藻TAG生物合成中的作用,进一步构建获得了GPAT1和AGPAT1双节点联合作用的过表达藻株。结果发现GPAT1和AGPAT1联合作用会促进TAG明显积累。联合作用影响了微藻对数期中期的生长,可能是额外生成叶绿体中光合膜导致。此外,我们首次揭示叶绿体定位的GPAT1和AGPAT1通过原核途径从头合成脂肪酸用于叶绿体TAG合成途径。3、三角褐指藻的脂肪酸组分中含有较高比例的长链多不饱和脂肪酸(Long chain polyunsaturated fatty acid,LC-PUFA),本研究对合成途径中的潜在关键节点丙酰基甲酰基载体蛋白转移酶(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase,MCAT)和脂肪酸去饱和酶5b(Desaturase 5b,D5b)进行了鉴定。结果发现,双节点联合作用下,藻株中LC-PUFA快速大量积累。其中花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)的含量分别高达18.98μg/mg和9.15μg/mg。我们首次将微藻中二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)含量提升至高达85.35μg/mg(干重)。除此之外,我们发现ARA和EPA主要积累于甘油三酯中,而DHA则主要集中在磷脂中。这两个关键节点联合作用导致LC-PUFA的高表达,而对微藻生长速率无影响。4、为了解油体的蛋白组成和调控机制,本研究中,我们对潜在油体组成蛋白LDP1进行了功能鉴定。LDP1与另一个硅藻Fistulifera sp.油体相关蛋白DOAP1具有同源性。LDP1的过表达提高了脂质含量、增加了油体大小、上调了涉及甘油三酯和脂肪酸合成相关基因的表达水平。相反,通过RNAi敲低LDP1会降低脂质含量、减少油体体积。此外我们分离了缺氮处理下三角褐指藻的油体,通过质谱分析了油体蛋白组分,发现LDP1存在于油体蛋白组分中并且丰度较高。重要的是,我们通过利用EYFP进行定位确定了LDP1存在于油体。5、鉴于人类的非酒精性脂肪肝相关的重要蛋白含patatin样磷脂酶域3蛋白(Patatin-like phospholipase domain-containing protein 3,PNPLA3)可促进肝脏中脂质合成,我们在三角褐指藻中寻找并鉴定出了类似PNPLA3功能的蛋白,过表达藻的内源PNPLA3提高了脂质累积水平,脂肪酸组分有所改变。我们又将人源的PNPLA3I148M首次在三角褐指藻中进行了异源表达,发现PNPLA3I148M显著提高了微藻脂质含量和改变了脂肪酸组成。总体而言,本论文首次发现了三角褐指藻存在叶绿体甘油三酯合成和组装机制,报道了新鉴定的油体蛋白,并揭示了油体蛋白参与了脂质合成和油体生成,提供了多节点共同调控的策略提升脂质和多不饱和脂肪酸合成,同时获得了脂质和多不饱和脂肪酸含量显著提高的转化藻株。这些结果提升了对微藻脂质代谢机制的认知,并为推动微藻资源高值化利用提供了理论依据和新的思路。