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第一部分肺癌铂类化疗过程中,NRF2信号通路存在激活,且激活程度与KEAP1突变状态相关目的:NRF2是调节细胞氧化还原反应的极为关键的具有碱性亮氨酸拉链结构的转录因子,具有保持细胞还原状态,调节细胞能量代谢的重要作用。NRF2的功能在蛋白水平受到KEAP1蛋白的拮抗,在受到外来刺激的同时,又在KEAP1蛋白的帮助下入核发挥促转录的功能。在肺癌的化疗过程中,NRF2信号通路的激活过程并未被深入研究。此部分内我们将着重探究NRF2信号通路在不同KEAP1突变状态的肺癌细胞系化疗过程中表达水平的变化,并研究干预这一信号通路对肺癌细胞化疗敏感性的影响。方法:1.Sanger测序确定肺癌细胞系A549,H460,H292和SKMES-1中KEAP1基因突变状态,蛋白电泳分析上述细胞中NRF2信号通路基础蛋白表达状况。2.荧光定量PCR,蛋白电泳及免疫荧光方法分析NRF2信号通路在肺癌细胞A549,H292顺铂化疗过程中的变化。3.构建NRF2信号通路主要的下游基因HO1,NQO1,GCLM启动子荧光素酶报告基因质粒,检测上述基因启动子在肺癌细胞铂类化疗过程中活性的变化。4.构建p D236H和p G333C突变的KEAP1过表达质粒,预转染上述突变质粒于H292及SKMES-1及野生型质粒于A549及H460细胞,CCK8法检测四种肺癌细胞对于铂类药物敏感性的变化。5.RNA干扰及t BHQ预处理H292及SKMES-1细胞,蛋白电泳分析RNA干扰A549及t BHQ预处理H292后接受顺铂处理引起的核损伤标志物γ-H2AX表达变化,CCK8法检测两种肺癌细胞对于铂类药物敏感性的变化。结果:1.A549细胞KEAP1基因333位氨基酸位点由甘氨酸突变为半胱氨酸(p G333C),H460细胞KEAP1基因236位氨基酸位点由天冬氨酸突变为组氨酸(p D236H),H292细胞和SKMES-1细胞KEAP1基因均未发现任何氨基酸位点突变;KEAP1突变细胞系A549和H460具有更高的NRF2蛋白核表达和下游基因表达。2.KEAP1突变细胞系接受顺铂处理后,m RNA和蛋白水平上升更加明显,这种趋势在KEAP1野生型细胞系不明显。3.荧光素酶报告基因结果显示,KEAP1突变型细胞系A549中,NRF2下游基因启动子活化明显,这种趋势在KEAP1野生型细胞系H292中不明显。4.过表达突变KEAP1蛋白导致肺癌细胞系H292和SKMES-1中NRF2信号通路激活,对顺铂治疗抵抗,过表达野生KEAP1蛋白导致A549和H460中NRF2信号通路抑制,使其对顺铂治疗更敏感。5.沉默和激活NRF2分别导致H292和SKMES-1细胞对顺铂治疗敏感性增加或者降低,在此过程中,顺铂治疗引起的核损伤程度变化是敏感性改变的一个机制。结论:顺铂处理过程中,NRF2信号通路的激活在KEAP1基因发生失能突变的细胞系中更显著,干预NRF2信号能显著改变肺癌细胞对于顺铂治疗的敏感性。第二部分肺癌放疗过程中,NRF2信号通路存在激活,且激活程度与KEAP1突变状态相关目的:电离辐射的间接生物学效应所产生的氧自由基及亲电类基团,是NRF2信号通路激活的适宜刺激。这一部分内我们将着重探究NRF2信号通路在不同KEAP1突变状态肺癌细胞系受放射线作用后表达水平的变化,并研究干预NRF2信号通路对肺癌细胞放疗敏感性的影响。方法:1.荧光素酶报告基因,蛋白电泳分析NRF2信号通路在肺癌细胞A549,H292放疗过程中的变化。2.检索Array Express数据库,通过分析核糖体m RNA芯片数据GSE10547验证肺癌细胞系中NRF2信号通路在放疗过程中翻译水平的激活。3.RNA干扰A549及t BHQ预处理H292细胞,流式细胞术检测两种肺癌细胞受放疗诱导凋亡比例的变化,蛋白电泳分析RNA干扰A549及t BHQ预处理后接受放疗处理引起的核损伤标志物γ-H2AX表达变化,克隆形成实验检测两种肺癌细胞接受放疗后形成克隆的能力变化。结果:1.KEAP1突变的A549细胞接受放疗后,NRF2下游基因启动子活化明显,KEAP1野生的H292细胞中,活化不明显,蛋白水平变化与启动子活性变化一致。2.公共数据库GSE10547中NRF2信号通路在A549和HOP62细胞中翻译水平变化趋势与上述研究结果一致。3.沉默NRF2导致A549细胞被放疗诱导的凋亡细胞比例增加,激活NRF2导致H292细胞被放疗诱导的凋亡细胞比例减少,同时沉默NRF2导致A549细胞被放疗诱导的活性氧水平增加,激活NRF2导致H292细胞被放疗诱导的活性氧水平减少,沉默NRF2导致A549细胞放疗后形成克隆数量减少,激活NRF2导致H292形成克隆数增多。结论:放射线照射过程中,NRF2信号通路的激活在KEAP1基因发生失能突变的A549细胞系中更显著,干预NRF2信号能显著改变肺癌细胞对于放射治疗的敏感性。第三部分NRF2调节KEAP1转录,机制研究显示这种激活通过结合KEAP1启动子中的抗氧化反应元件实现目的:确认NRF2调节KEAP1转录的现象,探索NRF2使KEAP1转录激活的机制,明确KEAP1启动子中抗氧化反应元件的作用。方法:1.免疫蛋白电泳检测肺上皮细胞BEASE-2B,肺癌细胞H292,SKMES-1中KEAP1蛋白在NRF2激活剂t BHQ刺激下,以及A549细胞在NRF2被小RNA干扰下的变化趋势。2.构建敲除SP1或(和)ARE位点的突变KEAP1启动子,利用荧光素酶报告基因检测KEAP1启动子导入HEK293T,H292和A549细胞中活性变化,确定NRF2作用于KEAP1启动子的具体位点。3.检索Array Express数据库,使用bowtie2,samtools,MACS2等经典软件,分析Ch IP-seq数据GSE37589验证NRF2蛋白与KEAP1启动子的直接结合。4.使用CRISPR-Cas9技术敲除KEAP1启动子中的抗氧化反应元件,QPCR检测KEAP1m RNA的变化。结果:1.NRF2激活剂可显著增加NRF2低功能的BEASE-2B,H292和SKMES-1细胞中KEAP1蛋白表达量,一段时间后表现反馈性抑制的现象;而沉默NRF2的处理可使NRF2高功能的A549细胞中KEAP1表达降低。2.在KEAP1野生,NRF2低功能的HEK29T和H292细胞中,敲除ARE位点可显著抑制KEAP1启动子基础水平和诱导水平(t BHQ及NRF2过表达质粒)的转录活性,敲除SP1位点则无抑制作用,而在KEAP1突变,NRF2水平高的A549细胞中,敲除ARE位点仅可抑制KEAP1启动子基础水平的转录活性。3.通过生物信息学分析GSE37589,发现KEAP1启动子区域(chr19:10502601-10503002)在NRF2激活剂SFN的处理中具有非常高的富集度(p=1E-59.81,q=1E-52.53),这一区域与荧光素酶质粒上KEAP1启动子序列重合。4.经过CRISPR-Cas9技术敲除,发现HEK293T和H292细胞系基因组敲除ARE元件可显著降低KEAP1m RNA的基础表达水平。结论:研究提示在肺上皮细胞和肺癌细胞中KEAP1蛋白受到NRF2因子的调节,且这一调节通过KEAP1启动子区域(chr19:10502601-10503002)与NRF2因子的直接结合实现。第四部分临床样本中NRF2调节KEAP1转录的证据目的:确认NRF2调节KEAP1转录的基础机制,探索NRF2调节KEAP1的临床证据。方法:1.使用TCGA-assembler和xena从TCGA数据库分别获取肺鳞癌(LUSC)和肺腺癌(LUAD)数据集的RNA-seq(illumine Hi Seq),甲基化芯片(450K)和DNA拷贝数数据,使用多元回归纵向分析NRF2和KEAP1在m RNA水平的相关性。2.获取受NRF2调节的基因名单,检索GEO数据库,获取肺癌组织RNA表达谱芯片数据集,连同前述TCGA肺癌RNA-seq数据集,使用bioconductor中的WGCNA包对各数据集中NRF2调节基因进行静态建模,使用各基因模块主特征值对NRF2和KEAP1的m RNA进行相关性分析。3.使用荟萃分析的方法比较两种肺癌类型中NRF2和KEAP1在m RNA水平上的区别,以及分析NRF2或KEAP1体细胞突变对这两个基因表达相关性可能的影响。结果:1.KEAP1基因表达在肺鳞癌样本中与NRF2基因表达高度相关,5UTR和基因体区域甲基化程度有力影响KEAP1表达。2.KEAP1表达在肺鳞癌中与多个NRF2下游基因模块主特征值相关,且相关方向与NRF2相同。3.荟萃分析显示,NRF2在肺鳞癌中的m RNA表达显著高于肺腺癌(OR:4.40,95%CI:3.34-5.79),同时KEAP1在肺鳞癌中的m RNA表达也显著高于肺腺癌(OR:2.79,95%CI:2.15,3.62)。TCGA-LUAD数据集中KEAP1体细胞突变的肿瘤样本中KEAP1基因m RNA显著高于KEAP1基因野生型样本(t-test p=0.0178),TCGA-LUSC数据集中NRF2通路体细胞突变(NRF2/CUL3/KEAP1任一基因体细胞突变)的肿瘤样本中KEAP1基因m RNA显著高于通路无图突变样本(t-test p=0.0001)。结论:研究表明KEAP1基因m RNA受NRF2调节的现象可能存在于肺癌组织样本中,这种相关性主要存在于肺鳞癌中,这可能与肺鳞癌具有较高的NRF2表达有关,KEAP1基因或NRF2通路体细胞突变的样本高表达KEAP1m RNA为这种可能提供了佐证。