论文部分内容阅读
肾细胞癌(rena cell carcinoma，RCC)是成人肾脏常见肿瘤，在我国泌尿系统肿瘤中位居第三，死亡率高达40％，且发病率以2-3％的比率逐年上升。RCC是一种与遗传、环境、代谢等相关的疾病，但发病机制至今不详，且多数病人对化疗药物不敏感。目前临床尚无RCC特异诊断标志物，一些常用分子标志物灵敏性和特异性较低。因此，寻找具有潜在临床应用前景的RCC分子标志物，阐明其在RCC发生发展中的作用机制，探索新的诊治策略，显得尤为迫切和重要。 微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类长约19～24个非编码单链小RNA分子，它们通过与靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)3端非翻译区(3-untranslated region，3-UTR)完全或部分互补结合，导致靶mRNA降解或翻译抑制从而在转录后水平调控靶基因表达。许多miRNA在肿瘤发生发展过程中发挥着抑癌基因或癌基因样的作用。已有研究报道，一些miRNA在RCC组织和细胞中异常表达，并通过影响肾癌细胞的增殖、凋亡、迁移等参与RCC的发生发展。我们前期研究发现，miR-28-5p在RCC患者血清中的表达水平显著降低，提示其可作为RCC潜在分子标志物-。但是，miR-28-5p在RCC组织中是否异常表达，是否参与RCC的发生发展尚不清楚。 目的:检测miR-28-5p在RCC组织中的表达情况，探讨其在RCC发生发展中的作用和机制。 方法:通过实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测34对RCC组织和相应的癌旁正常组织、多种人肾癌细胞及对照细胞株中miR-28-5p的表达水平。生物信息学预测miR-28-5p的靶基因，荧光素酶报告基因验证其靶向作用。免疫组化和Western Blotting(WB)技术分别检测靶基因在肾癌组织和肾癌细胞株中的表达变化。脂质体转染法或慢病毒转染技术实现对肾癌细胞株A498和ACHN中miR-28-5p或靶基因的过表达或抑制。CCK-8法检测细胞增殖，伤口愈合实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移。 结果: qRT-PCR结果显示，miR-28-5p在RCC组织的表达量显著低于癌旁正常组织(P＜0.05);miR-28-5p在人肾癌细胞株中A498、ACHN和Caki-1中的表达量也明显低于人正常肾细胞株HK-2（分别为P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01）。生物信息学预测显示RAS家族相关蛋白1B(RAS related protein1b，RAP1B)是miR-28-5p的可能的靶基因;荧光素酶报告基因分析证实，在293T细胞中过表达miR-28-5p可剂量依赖性地抑制含有RAP1B3-UTR的荧光素酶报告基因的荧光素酶活性;而过表达miR-28-5p突变体则不影响荧光素酶活性，证实miR-28-5p可直接作用于RAP1B的3-UTR，RAP1B是miR-28-5p的直接靶基因。对RAP1B的研究发现，在RCC组织中RAP1B免疫组化阳性反应程度明显高于相应的癌旁正常组织（P＜0.01），且与miR-28-5p的表达量呈显著负相关（R=-0.748，P=0.02）;在肾癌细胞系中，与miR-28-5p表达水平相反，WB分析显示RAP1B蛋白表达量明显上调（P＜0.01）。为进一步证实miR-28-5p对RAP1B的负向调控作用，在A498和ACHN细胞中，瞬时或稳定过表达miR-28-5p后，发现RAP1B蛋白水平明显下调（P＜0.01）;反之，抑制miR-28-5p的表达后RAP1B蛋白表达显著上调;而RAP1B mRNA水平则无明显变化，证实了miR-28-5p对RAP1B的调控是经典的转录后水平调控。体外细胞功能研究显示，过表达miR-28-5p可显著抑制A498和ACHN细胞的增殖及A498细胞的迁移;与之相反，抑制miR-28-5p表达则显著增强A498和ACHN细胞的增殖及A498细胞的迁移，提示miR-28-5p可抑制肾癌细胞的增殖与迁移，是一种抑癌miRNA。对RAP1B的功能研究显示，在A498细胞中干扰RAP1B可有效抑制细胞的增殖与迁移;而过表达RAP1B则可导致细胞增殖与迁移显著增强，提示RAP1B在RCC中起原癌基因作用。进一步功能回复实验显示，在A498细胞中过表达RAP1B后，能有效回复miR-28-5p对细胞增殖及迁移的抑制作用，说明miR-28-5p是通过抑制RAP1B的表达来负向调控肾癌细胞的生物学功能。最后，对RAP1B的一些下游靶基因的检测显示，过表达或抑制miR-28-5p可抑制或增强MAPK信号通路相关蛋白p38和ERK1/2的磷酸化水平。 结论:miR-28-5p作为一种抑癌基因，通过靶向作用于原癌基因RAP1B，抑制肾癌细胞的增殖和迁移，在肾癌的发生发展中起重要作用。miR-28-5p可作为RCC新的潜在的诊治靶标。