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具有刺激响应性以及靶向性的聚合物纳米粒子是一类新型的药物控释载体,它们可以降低药物副作用、提高药物的生物利用度。刺激响应性纳米粒子可以在外界环境变化时受到刺激而产生物理或化学变化,从分子水平上改变聚合物分子链之间或聚合物分子链与溶剂之间的相互作用,从而调控药物的释放,在生物医学领域具有潜在的应用前景。 为了获得可同时用作抗肿瘤药物载体和基因载体的聚合物,本文利用开环聚合(ROP)、原子转移自由基聚合(ATRP)以及点击(“Click”)化学反应相结合,设计合成了分子中含半乳糖胺(Gal,靶向作用)、缩醛基(-a-,pH敏感)和二硫键(-ss-,还原敏感)的聚磷酸酯、聚己内酯和聚甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯三嵌段共聚物(Gal-PEEP-a-PCL-ss-PDMAEMA),赋予该共聚物良好的生物相容性和在肿瘤细胞环境中降解释放药物和DNA的性能。本文对共聚物的合成方法进行研究,并对共聚物的结构进行表征。最后,运用所合成的共聚物进行体外细胞毒性和细胞摄取及基因转染实验研究,得到了较好的结果。本文的研究内容分为以下两个部分: 一、具有靶向分子和 pH/还原双重响应性的聚磷酸酯共聚物Gal-PEEP-a-PCL-ss-PDMAEMA的合成 利用一端含溴、另一端含羟基的小分子有机物2’-溴代异丁酰-2-羟乙基二硫酯(HO-ss-Br)作为引发剂,对己内酯(ε-CL)进行开环聚合,得到分子链一端带有羟基、另一端带有溴取代基的大分子引发剂(HO-PCL-ss-Br),然后利用均聚物聚己内酯(PCL)链末端的羟基,与2-氯乙基乙烯基醚(CEVE)反应,得到分子链末端含缩醛基的均聚物(Cl-a-PCL-ss-Br);利用 PCL末端的溴取代基作为 ATRP引发反应活性点,与pH敏感的甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)进行溶液ATRP反应,接着将分子链另一端的氯基与叠氮化钠(NaN3)反应,获得末端含叠氮基的阳离子型两嵌段共聚物 N3-a-PCL-ss-PDMAEMA。 采用有机小分子丙炔醇,以辛酸亚锡为催化剂,对环状磷酸酯单体2-乙氧基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(EOP)进行开环聚合,得到分子链末端带有炔基的聚磷酸酯 propargyl-PEEP,与上述末端含叠氮基的阳离子型两嵌段共聚物 N3-a-PCL-ss-PDMAEMA进行“Click”反应,CuBr/bpy为催化剂,获得具有pH/还原双重响应性的三嵌段共聚物 PEEP-a-PCL-ss-PDMAEMA。最后,经酰胺化反应,在三嵌段共聚物的末端修饰半乳糖胺(Gal),获得具有靶向分子和 pH、还原双重响应性、可同时作为药物和基因载体的三嵌段共聚物Gal-PEEP-a-PCL-ss-PDMAEMA。 二、Gal-PEEP-a-PCL-ss-PDMAEMA的表征及其体外生物性能研究 通过核磁共振波谱(1H NMR、13C NMR)、红外光谱(FT-IR)和GPC对所得聚合物的结构、分子量及分子量分布进行表征。利用荧光探针测试方法、透射电子显微镜(TEM)及动态光散射(DLS)对高分子载体的自组装纳米粒子的形貌、粒径及粒径分布进行表征。在模拟肿瘤细胞的环境中,缩醛基可在弱酸性环境中发生断裂,同时,在还原剂谷胱甘肽存在下,二硫键发生断裂,从而使三嵌段共聚物链断裂,胶束被破坏,同时释放出抗肿瘤药物阿霉素(DOX)和 DNA。利用 MTT法进行体外细胞毒性分析,结果表明,三嵌段共聚物具有良好的生物相容性和低毒性。通过凝胶阻滞电泳、体外药物释放、细胞内吞和转染实验等,验证Gal-PEEP-a-PCL-ss-PDMAEMA形成的阳离子型胶束可以同时包载 DNA和 DOX,并可成功内吞进入人宫颈癌细胞(HeLa cells)和肝癌细胞(HepG2 cells),且由于半乳糖胺特异性受体(ASGPRs)的介导作用,使得高分子载体在HepG2细胞的内吞和转染效率增强,证明半乳糖胺修饰的高分子载体具有靶向作用。