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目的:本课题首先以人肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)细胞株(HepG2)为模型,探讨水飞蓟宾是否抑制HCC HepG2细胞的侵袭和转移。其次,神经钙粘蛋白(N-cadherin)是恶性肿瘤细胞上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的重要标志物。利用表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)建立细胞EMT模型,研究水飞蓟宾是否通过抑制N-cadherin的表达而逆转EMT过程,进而抑制HCC的转移。在此基础上进一步研究水飞蓟宾对N-cadherin相关的信号通路蛋白的影响。方法:1.作用研究:采用MTT法观察水飞蓟宾对HepG2细胞的增殖抑制作用;采用细胞划痕实验和Transwell小室法观察水飞蓟宾对HepG2细胞迁移的作用;采用Transwell小室法检测水飞蓟宾对细胞迁移与侵袭能力的影响;通过RT-PCR方法检测迁移相关基因 Twist、Snail、Slug、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-11(MMP-11)和MMP-13的表达水平;采用单因素方差分析方法比较不同浓度水飞蓟宾对细胞活力、细胞迁移距离的和迁移细胞个数的影响,并比较各组间 Twist、Snail、Slug、VEGF、MMP-11 和 MMP-13 的转率,以P<0.05 为差异具有统计学意义。2.机制研究:首先利用EGF建立EMT模型。采用不同浓度(0,10,20ng/mL)的EGF诱导HCCHepG2细胞,观察EGF诱导后细胞形态的变化;通过细胞划痕和侵袭实验观察细胞迁移能力的变化;并通过RT-PCR和Western Blot实验重点观察N-cadherin、E钙粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)基因转录和表达水平的变化。最后,通过Western Blot方法检测水飞蓟宾对N-cadherin的下游蛋白ERK、Akt和MMP-9的表达。结果:1.作用研究:MTT检测结果显示不同浓度(30,60,120,240和480 μg/ml)水飞蓟宾可以抑制HepG2细胞增殖,抑制作用呈现剂量依赖和时间依赖性(P<0.05);细胞划痕和Transwell实验结果均显示,水飞蓟宾干预组HepG2细胞的迁移与侵袭能力均减弱,且随药物剂量的增大而更弱;RT-PCR结果显示,不同浓度的水飞蓟宾可以显著的降低HepG2细胞Twist、Snail和Slug基因的转录(p<0.05),水飞蓟宾可以不同程度下调VEGF和MMP-13的表达,但对MMP-11基因的转率无显著作用。2.机制研究:EGF诱导后细胞向成纤维样细胞形态改变;细胞划痕和侵袭实验的结果均表明EGF能够促进HCC HepG2细胞的迁移和侵袭能力;RT-PCR和Western Blot实验也分别从mRNA水平和蛋白水平,进一步说明EGF能够上调EMT标志物Viment in和N-cadherin的表达,与对照组比较有显著性差异(p<0.05)。但EGF没有显著下调E-cadherin蛋白的表达。RT-PCR和Western Blot结果均说明,水飞蓟宾干预可以明显降低N-cadh-erin基因的转录和蛋白的表达;但对Vimentin基因的转录和蛋白的表达没有明显的作用。另外,Western Blot实验结果表明水飞蓟宾可以显著下调ERK和AK T的表达(p<0.05),对MMP-9的表达无显著作用。结论:(1)水飞蓟宾可抑制人HCCHepG2细胞的增殖,迁移和侵袭。(2)水飞蓟宾可下调细胞Twist、Snail、Slug、VEGF和MMP-13基因的表达。(3)在EGF诱导EMT模型后,水飞蓟宾能够通过抑制N-cadherin的表达,逆转EMT,抑制HCCHepG2细胞的迁移和侵袭。(4)水飞蓟宾可能通过ERK1/2和Akt通路抑制HCC HepG2迁移和侵袭。