目的：　　细胞因子是免疫应答的重要效应分子和调节分子，参与多种疾病的发生和发展，多种细胞因子产品已进入临床，在抗病毒、抗肿瘤等疾病的治疗方面发挥重要作用。因此，揭示新的细胞因子功能和机制对免疫学的基础研究和临床应用有重要价值。IL-37是在2000年新发现的细胞因子，属于IL-1家族成员。IL-37有5个异构体(IL-37a-e)，至今研究较为广泛的是IL-37b，已有的证据表明IL-37b具有免疫负调控作用并参与多种疾病的发展。　　为了研究IL-37d功能，我们在分析IL-37d在人组织和细胞表达特点的基础上，制备了C57BL/6人IL-37d转基因小鼠，并利用LPS诱导的内毒素血症模型和高脂诱导的肥胖模型研究了IL-37d的功能，进而通过多项细胞和分子免疫学方法探索了其作用机制，获得了一些创新性结果，为对全面认识IL-37不同异构体的功能及将来的临床应用奠定了基础。　　方法：　　一、IL-37d的功能及其在控制内毒素血症中的作用　　1.设计IL-37d特异性引物，利用RT-PCR方法检测IL-37d在人体组织、细胞中的表达。　　2.用ELISA和CBA的方法检测IL-37d对炎性细胞因子和趋化因子表达的影响。　　3.构建C57BL/6背景的人IL-37d转基因小鼠，通过内毒素血症小鼠体内模型，检测IL-37d对于小鼠生存以及炎症的影响。　　4.用IL-1 R8 siRNA分别干扰A549细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中IL-37受体的表达，研究IL-37d是否通过细胞表面受体IL-1R8发挥作用。　　5.通过重组IL-37d蛋白，检测IL-37d是否通过细胞表面受体IL-1R8发挥作用。　　6.用IL-37的中和抗体，阻断IL-37dtg小鼠体内的IL-37d，研究IL-37d是否通过细胞表面受体IL-1R8发挥作用。　　二、 IL-37d在肥胖中的作用　　1.IL-37dtg小鼠和WT小鼠给与高脂饮食和正常饮食，通过检测体重、解剖后测量腹股沟处皮下脂肪、附睾脂肪和棕色脂肪重量以及HE染色观察组织细胞形态，确定IL-37d是否在饮食诱导的肥胖中发挥作用。　　2.IL-37d是否能够缓解高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。　　3.在高脂动物模型进行期间，通过葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验检测小鼠对血糖的处理能力及胰岛素的敏感性。通过ELISA方法检测血清中胰岛素的水平。　　4.通过对小鼠摄入量、运动和代谢的检测，确定IL-37d对小鼠肥胖的作用阶段。　　5.通过Western blot，qRT-PCR的方法检测代谢产热的关键分子UCP-1的表达。　　6.通过qRT-PCR和流式细胞术，检测脂肪组织中免疫细胞，如巨噬细胞和ILC2的比例及数量，确定发挥关键性作用的免疫细胞。　　7.通过qRT-PCR、Western blot和ELISA的方法，检测IL-37d对IL-33的表达的影响。　　结果：　　一、 IL-37d以Smad3依赖性方式抑制促炎性细胞因子的表达　　1.IL-37d在人PBMC、UCMSCs、ADSCs和脂肪组织中表达　　由于缺乏IL-37d的特异性抗体，我们设计了IL-37d特异性引物，用RT-PCR的方法检测IL-37d的表达并通过测序进行了确定。我们发现IL-37d在人外周血单核细胞(PBMCs)、脐带间充质干细胞(UCMSCs)、脂肪组织来源的基质细胞(ADSCs)和脂肪组织中有表达。并且发现IL-37d在肝癌细胞系HepG2、BEL-7402和Huh7中均有表达。说明IL-37d在人体组织和细胞中表达较为广泛，这丰富了以前报道认为IL-37d在骨髓和睾丸中表达观点。　　2.人IL-37d转基因小鼠的制备　　为了更好的研究IL-37d的功能，我们制备了人IL-37d转基因小鼠。将人IL-37d全长CDS区克隆到pRP.ExBi-EF1α-IRES-EGFP载体中，测序正确。将pRP.ExBi-EF1α-IL37-IRES-eGFP表达质粒注射来自C57BL/6小鼠的受精卵并植入到假孕的C57BL/6子宫内，以产生F0代小鼠。F0代雄性小鼠与C57BL/6野生型雌性交配并连续传代6代。然后对IL-37d阳性小鼠进行连续8代的自交，以产生IL-37d纯合子小鼠。对3～4周龄小鼠，通过PCR鉴定其基因型。使用PCR阴性的同窝小鼠和野生型小鼠作为对照。对IL-37dtg小鼠和对照小鼠腹腔注射LPS(10mg/kg)20h，取脾脏、骨髓和血清，通过PCR和ELISA检测IL-37d的表达。我们发现IL-37d在脾脏和骨髓中有表达。通过ELISA发现IL-37d在IL-37dtg小鼠血清中有表达，而在WT小鼠中则没有检测到表达。　　3.IL-37d抑制炎性细胞因子的表达　　为了探究IL-37d在免疫调节中的作用，我们首先通过过表达IL-37d，研究IL-37d对炎性细胞因子的影响。我们发现IL-37d能够明显抑制IL-1β诱导的IL-6的表达。为了进一步证实IL-37d的生物学功能，我们用来自IL-37dtg小鼠和WT小鼠的骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)，发现IL-37d能够明显抑制LPS诱导的IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。　　4.IL-37d改善LPS诱导的内毒素血症　　为了研究IL-37d在体内的作用，在IL-37dtg和野生型小鼠中使用LPS诱导的内毒素血症小鼠模型。发现在高LPS剂量诱导的致死模型中，IL-37d显着提高了该模型中小鼠的存活率。　　在亚致死LPS剂量的模型中，测量体温发现野生型小鼠体内的低温比IL-37dtg小鼠严重。并且IL-37dtg小鼠脾脏和血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-17A和趋化因子MCP-1的表达低于野生型小鼠。　　二、IL-37d在肥胖中的作用及机制　　1.IL-37d能够抑制高脂饮食诱导的肥胖　　首先，我们用雄性IL-37d和WT小鼠（6～8周），分别给与高脂饮食(60％脂肪)和普通饮食（10％脂肪）。我们发现高脂饮食组，IL-37dtg小鼠与WT相比，体重明显减轻。通过解剖小鼠我们发现，IL-37dtg小鼠腹股沟处的皮下脂肪和附睾脂肪均较WT小鼠体积小，质量轻。通过HE结果发现，IL-37dtg脂肪细胞体积明显小于野生型。 IL-37dtg小鼠其棕色脂肪较WT小鼠棕色颜色深，重量虽然有降低的趋势，但是无统计学差异。通过HE结果发现，高脂饮食组，IL-37dtg小鼠棕色脂肪细胞中，脂滴明显小于野生型。IL-37dtg小鼠的肝较WT小鼠体积小，颜色深，重量轻，肝表面未见明显的脂滴。通过HE结果发现，IL-37dtg小鼠肝细胞中脂滴明显小于野生型。这些结果表明，IL-37d能够抑制饮食诱导的肥胖。　　2.IL-37d改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗　　因为肥胖常伴随着血糖升高和胰岛素抵抗，故我们对高脂模型小鼠进行了葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验。发现高脂饮食组中，IL-37dtg小鼠的糖耐量高于WT小鼠，而正常饮食中，IL-37dtg小鼠和WT小鼠的糖耐量则没有明显的差异。在高脂饮食组中，IL-37dtg小鼠胰岛素的敏感性高于WT小鼠。通过ELISA检测小鼠血清中的胰岛素水平，发现高脂饮食组，IL-37dtg小鼠血清内胰岛素水平明显低于WT小鼠，而正常饮食中，IL-37dtg小鼠和WT小鼠没有明显的差异。这些结果表明，IL-37d能改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。　　3.IL-37d不影响小鼠的食物摄入量和运动　　通过对小鼠摄入量的检测发现，IL-37dtg小鼠和WT小鼠的摄入量没有差异。进一步对小鼠运动检测发现，IL-37dtg小鼠和WT小鼠的运动没有差异。这说明IL-37d抑制肥胖不依赖于饮食和运动。　　4.IL-37d促进氧化代谢并增加能量消耗　　为了研究IL-37d抑制肥胖是否是通过代谢通路进行的，我们用PhenoMaster高通量智能代谢分析系统对小鼠进行了代谢检测，发现在高脂饮食组中，IL-37dtg消耗更多的O2，生成更多的CO2，产生更多的热量。此外，呼吸交换率（Respiratoryexchange ratio，RER）结果显示，IL-37dtg小鼠对于能源的消耗更多的来源于脂肪。　　结论：　　一、IL-37d以Smad3依赖性方式抑制炎症　　1.IL-37d在人PBMC、UCMSCs、ADSCs和脂肪组织中广泛表达。　　2.IL-37d是有功能的IL-37异构体，与IL-37b一样具有免疫负调控作用并抑制LPS诱导的内毒素血症。　　3.在作用通路上，IL-37d与IL-37b不同，IL-37d主要通过Smad3的方式发挥抗炎作用，而对IL-1R8受体介导的通路依赖低。　　二、IL-37d上调IL-33的表达，促进和激活ILC2，抑制肥胖　　1.发现IL-37d能够抑制高脂饮食诱导的肥胖以及改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。　　2.IL-37d主要通过促进氧化代谢并增加能量消耗抑制肥胖。　　3.IL-37d促进耗能可能通过上调IL-33-ST2+淋巴细胞抑制炎症、促进耗能，从而抑制肥胖。