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HPLC是一种非常有效的分离方法,经常被用于“鸟枪法”蛋白质组学研究中。尽管近些年来在磷酸化蛋白质组分析领域有长足进步,但是几乎没有研究比较不同HPLC方法对磷酸化肽段的分离效率。为了弥补这一空白,我们使用MAC方法从Hela细胞全蛋白胰酶酶解产物中富集大量磷酸化肽段(磷酸化肽段纯度高达90%以上),然后将同批次等份磷酸化肽段混合物分别通过几种不同HPLC方法进行预分离,最后采用RPLC-MS/MS进行肽段鉴定。我们采用的HPLC方法包括强阳离子交换色谱(SCX)、亲水相互作用色谱(HILIC)和静电排斥亲水相互作用色谱(ERLIC)。我们发现每一种HPLC分离方法都能鉴定出4000-5000个非冗余磷酸化肽段,而且每种方法都有相当一部分属于自己独立鉴定出的磷酸化肽段。我们还发现每种HPLC方法都具有不同的分离特性,例如选择性、分辨率以及正交性。将几种HPLC方法鉴定出的数据合并在一起,我们总共能够得到9069个非冗余磷酸化肽段、9463个非冗余磷酸化位点和3260个非冗余磷酸化蛋白,表明不同HPLC分离方法之间具有互补性,可以被同时应用以扩大磷酸化蛋白质组覆盖范围。另外,我们还鉴定出许多未曾报道的磷酸化位点和磷酸化基序。在研究SNl烷基化试剂引起的变异和癌化机理实验中,N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)是最常用的一种化学试剂。MNNG能够引起DNA损伤。细胞的DNA损伤应答(DDR)反应非常复杂,涉及多种生物过程,例如DNA修复、细胞周期捕获、染色质畸变和细胞凋亡。DNA错配修复蛋白MutSα(MSH2和MSH6结合成的异源二聚体)能够识别MNNG引起的6MeG/T错配碱基,该过程位于DNA损伤应答信号传导途径的上游。为了研究DNA损伤应答的分子机制并探讨DNA错配修复蛋白在DNA损伤诱导的细胞凋亡中的作用,我们采用高通量蛋白质组技术并结合SILAC定量质谱、细胞核蛋白抽提、磷酸化肽段富集和多维色谱分离等技术检测TK6(拥有错配修复蛋白,MNNG导致细胞凋亡)和MT1(缺失错配修复蛋白(?)MSH6, MNNG不导致细胞凋亡)细胞经受MNNG刺激后磷酸化位点以及蛋白表达量变化情况。最终,我们在TK6和MT1细胞中分别成功定量了1108和901个磷酸化位点以及794和724个蛋白。通过定量蛋白质组学分析,我们对MNNG引起的细胞应答过程有了更深层次的理解。