自体免疫甲状腺病(AITD)是一种有器官特异性的自身免疫病。碘是合成甲状腺激素的主要原料,又是一类重要的甲状腺功能的调节因子。随着补碘防治碘缺乏病(IDD)工作的普及与深化,人们发现补碘使某些地区甲状腺自体免疫性疾病的发病率上升,因此,碘与甲状腺自体免疫功能关系的研究日益受到人们关注。流行病学资料表明,水源高碘地区甲状腺自体免疫性疾病(AITD)的发病率明显高于低碘区,在低碘地区过度补碘或在碘充足地区盲目补碘都可增加甲状腺自身免疫疾病的发病率。尽管我国外环境以缺碘为主,但在局部地区(接近6000万人口)由于生存环境中碘过多,居民摄碘过多,已构成严重的公共卫生问题,由此我们推测过量碘具有免疫毒性,但有关这方面的研究刚刚起步,资料甚少。所以,研究过量碘的免疫毒性,了解过量碘对免疫系统的危害,探讨过量碘作用下甲状腺自体免疫性疾病的发生和发展机制,采取有效的干预措施刻不容缓。硒是对免疫功能具有重要调节作用的微量元素,在甲状腺激素的合成、代谢及抗氧化等功能中具有重要作用,硒、碘在生理功能上有交叉之处,所以,我们设想以适量硒拮抗过量碘的免疫损伤。但到目前为止硒、碘关系的研究主要集中在抗氧化机制等方面,硒拮抗过量碘氧化损伤的观点已在实验中得到验证,而硒干预过量碘危害免疫损伤的研究国内外均未见报导。因此,本研究在观察过量碘对小鼠免疫系统毒性的基础上,应用原位杂交、ELISA、免疫组化、流式细胞分析等方法进一步研究过量碘对促甲状腺激素受体、促甲状腺激素受体抗体及树突状细胞抗原递呈功能等的影响,从分子水平上揭示过量碘导致甲状腺自体免疫性疾病的机理,同时通过补硒来观察硒对过量碘导致的免疫毒性的干预作用。现将结果报告如下:第一部分过量碘致小鼠免疫系统毒性影响的研究目的观察过量碘对小鼠细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫的影响,为评价过量碘对免疫系统的危害提供理论依据。方法将刚断乳的清洁级BALB/C雌性小鼠160只,按体重随机分为4组,分别给予自来水及含KIO:,的高碘水,高碘剂量分别为1500μg/L、3000μg/L、6000μg/L。30天后测定小鼠脏体比,淋巴细胞增殖反应能力,T细胞表面主要辅助分子CD4+、CD8’比值的变化,CD4+T细胞Thl,Th2比值的变化,半数溶血值,抗体生成细胞数,NK细胞活性,腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率、吞噬指数。结果含碘6000μg/L组的脾脏指数、半数溶血值显著低于正常对照组(p<0.05);抗体生成细胞数,CD4+/CD8+极显著低于对照组(p<0.01);淋巴细胞增殖反应能力、IFN-γ/IL-4比值、NK细胞活性%极显著高于对照组(p<0.01);腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率、吞噬指数及胸腺指数在各剂量组间的差异没有统计学意义。结论碘酸钾是与机体免疫反应相关的外源化学物质,小鼠饮水中含碘6000μg/L时即可造成免疫功能紊乱。第二部分过量碘致小鼠甲状腺自体免疫性疾病的研究目的观察过量碘致小鼠血清中T3、T4、TSH、TSHRAb、甲状腺IgG抗体水平的改变,分析甲状腺病理切片,探讨高剂量碘与小鼠甲状腺器官特异性免疫疾病的关系。方法采用120只BaLB/c雌性小鼠,按体重随机分6组,每组20只,分别给予0μg/L,1500μg/L,3000μg/L,6000μg/L,12000μg/L,24000μg/L的碘酸钾,动物饲养方法同前。饲养三个月后,取小鼠血清;同时取甲状腺于4%的多聚甲醛中固定,用于免疫组化分析及病理切片分析,结果(1)小鼠摄入高碘三个月后都出现了弥漫胶质性甲状腺肿现象。光镜下,可见正常对照组的甲状腺滤泡中等大小,呈圆形或椭圆形,滤泡上皮细胞多为单层立方状或高柱状。而各高碘组甲状腺滤泡明显增大,滤泡腔内充满红色胶质,上皮细胞呈扁平状且滤泡有融合现象。(2)高碘摄入可升高血清TT、TSH,降低血清TT3。血清TT4、TT3和TSH水平从3000μgI/L组开始与对照组相比有显著性差异(p<0.05)。TT3、TT4和TSH水平与碘都呈显著剂量关系,尤其是对机体内分泌有着重要调节作用的TT3和TSH相关系数分别达到r=-0.65和r=0.677。(3)高碘摄入可升高小鼠甲状腺IgG抗体的水平及血清TSHRAb的水平,且小鼠甲状腺IgG抗体的水平,TSHRAb抗体的水平从6000μg/L组开始与对照组相比有显著性差异,并呈显著(p<0.05)和极显著剂量效应关系(p<0.01)。亦即说明IgG类抗体TSHRAb随碘剂量增加而升高。结论(1)过量碘摄入可诱发甲状腺自体免疫性疾病。(2)过量碘诱发的甲状腺自体免疫反应以体液免疫为主。(3)6000μg/L以上碘剂量具有诱发小鼠甲状腺自体免疫性疾病的危险。第三部分过量碘致甲状腺自体免疫性疾病机制的研究目的观察饲喂小鼠高剂量碘一个月和三个月后血清中抗氧化酶及脱碘酶活性变化,肝中Se的变化,尿中碘的变化及三个月后DC抗原递呈功能的变化,脾小体的变化,TSH受体mRNA表达水平的改变,深入研究过量碘致甲状腺自体免疫性疾病的机制。方法试验动物分组同前,0μgI/L, 6000μgI/L, 24000μgI/L组每组多10只,供DC细胞原代培养。分别取小鼠一个月和三个月的血清测定SOD、MDA、GPX的变化,肝、肾中5’-脱碘酶活性的变化,同时测肝中硒的变化尿碘的变化。饲喂高剂量碘三个月后进行DC细胞原代培养.检测DC细胞表面标记CDllcCD86 CD80 MHCⅡ的变化(流式),并取甲状腺于4%的多聚甲醛中固定,用于TSH受体mRNA表达水平(原位杂交)检测,取脾于4%的多聚甲醛中固定用于病理分析。结果(1)饲喂过量碘一个月和三个月的小鼠尿碘水平都极显著的高于对照组(p<0.01)。尿碘与碘剂量的相关分析表明,一个月和三个月尿碘水平与碘剂量都呈极显著正相关(p<0.01),碘剂量越高,尿碘水平也越高。一个月和三个月的尿碘相近,说明机体对碘的吸收在一个月时就已超出了正常需碘水平,继续以过量的碘水喂养,很可能给机体造成危害。高碘摄入可降低机体的肝硒水平。在三个月时,从3000μgI/L组开始与对照组有显著性(p<0.05)或极显著(p<0.01)差异,并且成显著剂量效应关系。在一个月时,虽有下降趋势,但与对照组相比无显著差异,并且没有剂量效应关系。(2)饲喂过量碘一个月和三个月,各高碘组的血清GSH-Px活性、SOD都呈下降趋势,GSH-Px活性一个月时与对照组相比没有显著差异,三个月时从1500μgI/L组开始分别与对照组有显著性(p<0.05)和极显著性(p<0.01)差异;三个月时GSH-Px活性与碘剂量呈极显著负相关(r=-0.566 p<0.01)。SOD一个月时从3000μgI/L组开始与对照组相比就有显著差异(p<0.05),三个月时从1500μgI/L组开始分别与对照组就有显著性(p<0.05)和极显著性(p<0.01)差异;无论一个月、三个月,血清SOD值与碘剂量都呈极显著负相关(p<0.01),三个月时相关系数达到r=-0.705。在一个月和三个月,小鼠血清MDA都随碘剂量升高而升高。一个月时,从6000μgI/L组开始与对照组有显著性(p<0.05)差异,三个月时从3000μgI/L开始与对照组有显著性(p<0.05)和极显著性(p<0.01)差异;MDA水平从3000μgI/L组开始显著高于对照组(p<0.05),同时与碘呈现极显著的剂量效应关系(r=-0.827,p<0.01)。(3)饲喂过量碘一个月和三个月对小鼠肝脏1型脱碘酶活性都呈降低趋势。在三个月,从3000μg/LI组开始,小鼠肝脏1型脱碘酶活性显著(p<0.05)或极显著低于对照组(p<0.01),并且成显著剂量效应关系(p<0.05)。在一个月,虽有下降趋势,但与对照组相比无显著差异,并且没有剂量效应关系。(4)高碘摄入可使小鼠促甲状腺激素受体mRNA表达水平升高。在三个月时,从3000μgI/L组开始与对照组有显著性(p<0.05)或极显著(p<0.01)差异,并且成显著剂量效应关系。在一个月时,虽有下降趋势,但与对照组相比无显著差异,并且没有剂量效应关系。(5)过量碘摄入可使小鼠树突状细胞DC上共刺激分子CD80、CD86表达升高,与对照组相比有极显著差异(p<0.01),并与碘摄入成极显著剂量效应关系。细胞表面抗原组织相容性复合物MHC-Ⅱ类分子在高碘状态下表达明显升高,与对照组相比有极显著差异,并成显著剂量效应关系。(r=0.963,p<0.01)。高碘使DC细胞上特征表达标志CD11c表达增强,剂量组与对照组相比有极显著差异,并成显著剂量效应关系(r=0.966,p<0.01)。(6)与正常对照组比,高碘组脾小体明显增大。结论:(1)过量碘使机体抗氧化水平降低,易使机体产生氧化损伤(2)过量碘耗硒。机体肝硒含量降低,对机体甲状腺激素分泌具有重要作用的含硒酶活性降低。(3)过量碘使DC抗原递呈功能增强,机体特异性的局部免疫反应随之产生并增强。通过信号传导B细胞被激活,从而产生自身抗体。(4)过量碘作用下,自身抗体TSHRAb产生,同时TSH上升,造成TSHRAb与TSH竞争TSH受体,使TSH受体mRNA的表达增强,从而使自身免疫反应加强。(5)1500μg/L、3000μg/L碘对机体首先造成氧化损伤,至6000μg/L碘机体才出现明显的自身免疫识别反应。认为6000μg/L是过量碘致甲状腺自身免疫性疾病的阈值。(6)过量碘免疫毒性具有累积作用。第四部分硒对过量碘所致免疫毒性的干预作用目的观察不同硒对过量碘所致免疫毒性的干预作用,探讨硒拮抗过量碘所致免疫毒性的机制。方法刚断乳的清洁级BALB/C雌性小鼠80只,按体重随机分为4组,每组20只动物,A组,即正常对照组,给予自来水;B组,单硒组,给予0.3mg/L的硒;C组为高碘组,给予6000μg/L的高碘水;D组为补硒组,给予6000p gI/L+0.3mgSe/L。动物饲养及实验取材同第二部分和第三部分。结果(1)硒干预可有效逆转过量碘造成的免疫功能的紊乱。加硒干预后,加硒组与高碘组相比,脾指数上升,OD差值由3.33±0.14降至2.04±0.29。上调了CD4+/CD8+,下调了IFN-γ/IL-4,抑制了Th,/Th2偏移使半数溶血值HC50、溶血空斑数和NK细胞活性与正常对照组没有显著差异。使细胞免疫功能、体液免疫功能及非特异性免疫功能接近正常状态。(2)硒干预可有效控制甲状腺自体免疫疾病症状的产生高碘组甲状腺滤泡明显增大,滤泡腔内充满红色胶质,上皮细胞呈扁平状。而补硒组的甲状腺滤泡腔有变小的趋势,上皮细胞也趋于正常的形态。高碘摄入可升高血清TT4、TSH,降低血清TT。。加硒可使血清TT4、TSH降低,血清TT3升高。高碘组与正常对照组相比具有极显著性差异(p<0.01)。加硒组TT3、TSH与高碘组相比有显著差异(p<0.05)、TT4有极显著差异(p<0.01)。说明硒干预高碘致机体甲状腺激素分泌紊乱是有效的。硒干预可明显降低小鼠甲状腺IgG抗体的水平,血清TSHRAb的水平,从而抑制TSH与TSHRAb对TSHRmRNA的竞争反应,使TSHRmRNA表达水平与对照组没有显著差异。(3)硒干预可提高机体肝硒水平高碘摄入可降低机体的肝硒水平;而加硒干预可提高肝硒水平,高碘组与正常对照组有极显著差异,加硒组与高碘组也有极显著差异。(4)硒干预可有效提高小鼠机体抗氧化水平肝脏的GSH-Px和血清中SOD、MDA在6000μgI/L高碘状态下与对照组有极显著性(p<0.01)差异,加硒可升高GSH-Px活性和SOD值,降低MDA值。加硒组GSH-Px与高碘组比有显著差异(p<0.05);SOD、MDA与高碘组比有极显著性(p<O.01)。(5)硒干预可有效提高小鼠肝脏1型脱碘酶活性6000μgI/L组肝脏1型脱碘酶活性极显著低于对照组(p<O.01),加硒干预可上调肝脏1型脱碘酶活性。加硒组与高碘组相比有显著差异(p<0.05)。(6)硒干预可有效控制过量碘造成的DC抗原递呈功能的增强。过量碘摄入可使小鼠树突状细胞DC上共刺激分子CD80、CD86表达升高,与对照组相比有极显著差异(p<0.01)。细胞表面抗原组织相容性复合物MHC-Ⅱ类分子在高碘状态下表达明显升高,与对照组相比有极显著差异(p<0.01)。高碘使DC细胞上特征表达标志CD11c表达增强,剂量组与对照组相比有极显著差异(p<0.01)。加硒干预组各使各指标下调,虽然与高剂量组相比没有显著差异,但与对照组相比也没有显著差异,说明加硒干预对于是有效的。(7)硒干预可有效控制过量碘造成的脾结构的改变过量碘摄入在使DC抗原递呈能力明显增强的同时,B细胞积聚的部位-脾小体明显增大,而硒干预组脾小体与对照组较为接近,说明硒干预可在有效控制过量碘造成的DC抗原递呈功能的增强的同时,针对自身的体液反应也得到了有效控制。结论:补硒可明显改善高碘动物的硒营养状况,扭转过量碘所致的免疫功能的紊乱;通过增强机体的抗氧化能力减小甲状腺的氧化损伤程度,维持正常的DC抗原递呈功能,减少机体的免疫损伤;通过上调甲状腺激素代谢过程中的关键酶-脱碘酶的活性,维持机体的甲状腺激素水平,从而抑制机体的自我识别反应,降低甲状腺自体免疫性疾病的发病危险。本实验证明,0.3mgSe/L(即0.075mg/kgbw.)是拮抗6000μg/L浓度过量碘所致免疫毒性的适宜的硒剂量。本研究的创新之处:1.首次系统全面地观察了过量碘所致的对机体免疫系统的毒性作用。以往对于过量碘对免疫系统毒性作用的研究没有报道。本实验按照毒理学实验的要求,设置了一系列的高碘剂量,并严格设置了对照组,系统全面地观察了过量碘对小鼠免疫功能的影响,发现过量碘对免疫功能具有毒性作用,主要表现为导致免疫功能的紊乱,并提出6000ugI/L是过量碘致免疫功能毒性作用的阈剂量,为评价过量碘诱导甲状腺自体免疫性疾病机制提供了理论依据。2.对过量碘所致器官特异性自体免疫性疾病-甲状腺自体免疫性的机制进行了较为深入的探讨,首次提出过量碘对机体的氧化损伤、对含硒酶活性的抑制、使免疫细胞DC抗原提呈功能增强及TSH与TSHRAb竞争TSHR是过量碘所致免疫毒性的关键机制。并发现过量碘致BALB/C雌性小鼠甲状腺自体免疫性反应以体液反应为主。3.本研究另一个重要发现是观察到补充适宜剂量的硒可拮抗过量碘所致的整体免疫功能的毒性和器官特异性免疫毒性,并提出0.3mg/L是拮抗6000μg/L碘的适宜剂量。其机制是调节免疫细胞DC抗原提呈功能,增强机体的抗氧化能力和脱碘酶的活性、抑制TSH与TSHRAb竞争TSHR的反应,从而改善甲状腺的免疫损伤,为针对过量碘危害,采取膳食干预措施提供了理论依据。