研究背景:神经病理性疼痛（Neuropathic pain,NP）是临床上常见的一种慢性疾病,由周围或中枢神经多种疾患引起,如糖尿病、化疗药物、带状疱疹、神经压迫、中风等,常表现为自发性疼痛、痛觉过敏和异常性等症状。NP的药物治疗疗效有限,加之常用药物存在耐药性、依赖性等副作用,NP的治疗现状并不乐观。从草药中寻找新的镇痛药物一直是研究治疗NP的热点。研究显示中药提取物藜芦胺具有抗炎和镇痛的作用,但目前尚缺少对藜芦胺作用于NP以及机制的深入研究。因此,本研究拟通过藜芦胺作用于神经病理性模型大鼠模型,验证藜芦胺能否改善NP、是否具有一定的神经保护作用;同时,我们对藜芦胺发挥镇痛作用的分子机制进行初步探讨,发现其主要通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinases/protein kinase B,PI3K/Akt）信号通路在神经疼痛的治疗中发挥作用,以期为治疗NP提供理论基础。第一部分藜芦胺对CCI大鼠疼痛及炎症反应的影响目的通过建立慢性压迫损伤（chronic constriction injury,CCI）动物模型确定藜芦胺（Veratramine,Ver）是否能够改善CCI诱导的大鼠NP症状。方法本研究首先通过构建大鼠模型。组别分成7组,分别为1.健康对照control组;2.假手术sham组;3.造模Model组;4-6组为Ver-10、Ver-50和Ver150组,即分别通过尾静脉注射给予CCI大鼠10、50、150μg/kg藜芦胺进行28天的治疗;7.阳性药组（通过灌胃给予100mg/kg加巴喷丁）。各组在CCI术前1天和术后第7、14、21、28天进行机械痛阈值（mechanical withdrawal threshold,MWT）和热刺激爪退缩阈值（thermal paw withdrawal latency,TWL）检测。第28天实验结束时,大鼠腹主动脉取血,ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平。处死大鼠后,取L4-L5段脊髓组织,提取总RNA,q PCR检测脊髓组织中TNF-α、IL-1β和IL-6基因表达水平。结果大鼠在CCI术后第7天,同对照组和伪手术组比,MWT和TWL值均显著下降（P＜0.05）,给予50、150μg/kg藜芦胺处理21天后能恢复CCI大鼠MWT和TWL值。ELISA检测结果提示,Model组大鼠TNF-α,IL-1β及IL-6值同sham组相比显著升高（P＜0.05）。Ver各剂量组均可下调CCI大鼠血液中炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平,在Ver-50和Ver-150组中,差异具有统计学意义（P＜0.05）。q PCR检测结果显示,脊髓组织TNF-α、IL-1β及IL-6 m RNA水平在Model组中显著升高,而Ver各剂量组均可显著下调上述基因的表达水平,在Ver-50和Ver-150组中,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论藜芦胺可显著缓解CCI大鼠的NP,提高机械疼痛及热敏痛反应阈值,可能与抑制CCI大鼠炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平及基因表达有关。第二部分藜芦胺改善CCI大鼠病理损伤目的为进一步明确藜芦胺对CCI诱导的NP的缓解作用,本研究拟从组织病理角度分析藜芦胺对脊髓组织、坐骨神经结构和细胞凋亡的影响。方法在原来7组别上,即分别为1.control组;2.sham组;3.model组;4-6组:Ver-10、Ver-50和Ver-150组;7.加巴喷丁组。在第28天结束实验。取大鼠结扎段坐骨神经组织及L4-5段脊髓组织进行固定,脱水包埋。制成石蜡切片后,进行苏木精-伊红（HE）、末端标记法（Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL）染色。并通过免疫组化（Immuno Histo Chemistry,IHC）对裂解形式的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）进行染色。同时取部分L4-L5段脊髓组织,免疫印迹检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2等表达水平。结果病理检测结果显示,Model组和Ver-10组脊髓均出现大量的神经元萎缩。结扎侧脊髓背角处,能观察到胶质细胞分布紊乱。坐骨神经出现明显的空泡样变及神经纤维束的纤维化,神经细胞出现脱髓鞘现象,细胞核脱落。Control组的神经组织紧实致密。Ver-50和Ver-150神经束较为致密,未出现大规模纤维化及空泡样变,但可见明显肿胀现象。TUNEL及免疫组化染色结果显示,相较于control组,Model组TUNEL阳性率在脊髓背角和坐骨神经中均显著升高（P＜0.01）,cleaved caspase-3蛋白阳性水平增高（P＜0.01）。不同剂量藜芦胺均能显著减少脊髓背角和坐骨神经中细胞TUNEL染色阳性率,降低cleaved caspase-3在脊髓背角中的表达（P＜0.05）。免疫印迹结果显示,Ver-50和Ver-150组cleaved caspase-3及促凋亡蛋白Bax的表达水平被显著抑制,而抗凋亡蛋白Bcl-2与之相反（P＜0.05）。结论藜芦胺可通过抑制炎症反应来对CCI大鼠提供神经保护作用,包括抑制脊髓神经元萎缩和坐骨神经细胞脱髓鞘,减少神经细胞凋亡。第三部分藜芦胺对脊髓神经胶质细胞活化及p38 MAPK、NF-κB磷酸化的影响目的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）和核因子kappa B（nuclear factor-kappa B,NF-κB）通路的磷酸化能够持续诱导炎症及病理性疼痛的发生,对于CCI诱导的NP具有促进作用。因此,本部分拟围绕藜芦胺对脊髓胶质细胞的活化及p38MAPK和NF-κB通路的磷酸化展开研究。方法在原来7组别上,即分别为1.control组;2.sham组;3.model组;4-6组:Ver-10、Ver-50和Ver-150组;7.加巴喷丁组。在第28天结束实验。利用免疫荧光化学染色对脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞活化标志物Iba-1、GFAP以及p38MAPK磷酸化水平进行检测。结合免疫印迹对NFκB、p50、p65及IκB磷酸化水平进行检测。结果Model组中小胶质细胞和星形胶质细胞活化数量显著高于control组及不同剂量藜芦胺处理组（P＜0.05）,同时磷酸化p38 MAPK在脊髓中广泛表达。免疫印迹检测结果提示,model组脊髓中p50,p65及IκB磷酸化水平显著提高,同control组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。相较于model组,Ver-50和Ver-150组p50,p65及IκB磷酸化水平受到显著抑制（P＜0.05）。结论藜芦胺能够抑制小胶质细胞及星形胶质细胞的活化,缓解神经细胞中p38MAPK磷酸化,进而影响炎症因子转录相关的蛋白NF-κB激活,从而达到炎症抑制及疼痛缓解作用。第四部分藜芦胺通过PI3K/Akt通路发挥疼痛缓解作用目的由于目前对藜芦胺的研究报道较少,并且其对NP的具体作用机制仍是未知状态。因此,本研究将结合转录组及分子模拟对接技术对藜芦胺缓解NP的脊髓机制进行挖掘验证,以明确其发挥缓解疼痛作用的具体机制。方法首先本研究对control组,model组和Ver-50组大鼠L4-L5节段脊髓进行转录组分析验证。结合Pymol软件进行分子模拟对接。再通过构建大鼠CCI模型。除上述研究中的7组外,另补充第8组实验,即PI3K/Akt通路激动剂740YP+50μg/kg藜芦胺组（记作740YP+Ver组）。补充组的实验数据同前7组的实验数据做统一比较。利用免疫组化对大鼠结扎侧脊髓背角PI3K/Akt磷酸化水平进行检测。并通过免疫印迹检测PI3K/Akt通路蛋白以及NF-κB的磷酸化水平。通过RNA测序,分析差异表达基因,并进一步进行基因生物信息富集分析。结果GO和KEGG富集分析结果显示,藜芦胺能够显著抑制CCI大鼠PI3K/Akt信号通路。分子对接结果显示,藜芦胺与PI3K和Akt蛋白的结合能分别为-9.3kcal/mol和-10.8kcal/mol。免疫组化结果也证明Ver-50组脊髓背角处PI3K、Akt磷酸化水平显著低于model组（P＜0.05）。740 YP显著提高脊髓背角PI3K、Akt磷酸化水平。免疫印迹检测结果同IHC检测结果相符合,Ver-50和Ver-150组脊髓背角处PI3K/Akt通路及NF-κB通路磷酸化水平被显著抑制,同model组比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）。740 YP能够逆转藜芦胺对PI3K/Akt通路及NF-κB通路磷酸化水平的抑制作用,同Ver-50组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论藜芦胺可通过抑制PI3K/Akt通路磷酸化来减弱NF-κB的磷酸化水平,同时抑制脊髓胶质细胞活化和细胞炎症因子释放。从而降低中枢神经敏化,提高CCI大鼠TWL和MWT阈值,最终改善NP症状。综上所述:本研究通过四个部分实验逐步证明藜芦胺能够显著缓解CCI大鼠的NP,提高机械疼痛及热敏痛反应阈值,同时抑制了炎症反应（第一部分）。从脊髓及坐骨神经部位病理实验观察,发现藜芦胺能够抑制CCI诱导的脊髓神经元萎缩和坐骨神经细胞脱髓鞘,减少神经细胞凋亡（第二部分）,同时抑制小胶质细胞及星形胶质细胞病理性异常激活,从而达到炎症抑制及疼痛缓解作用（第三部分）。最后通过转录组数据及分子对接技术从宏观到具体去分析筛选藜芦胺的调控通路及靶标。进一步结合PI3K通路抑制剂740 YP进行回复性实验证明了藜芦胺抑制神经胶质细胞PI3K/Akt通路来减弱NF-κB的磷酸化水平,从而降低中枢神经敏化,最终改善NP症状。