论文部分内容阅读
基因组存储的生物信息通过转录过程传递给转录组,转录组经翻译过程编码蛋白质,生成蛋白质组,并将信息释放给细胞以调控生命活动。这一系列的过程被称为基因组表达,是生命活动中心法则的核心过程。基因突变和甲基化均会影响上述基因表达过程,且与生物体的生长、发育以及疾病的产生密切相关。研究表明癌症的发生与基因的特异性和异常的甲基化有直接的关系。在基因水平上,基因的突变只有经过转录传递给信使RNA(mRNA)才会最终影响生命活动,mRNA构成了转录组并作为基因表达过程中的核心执行者,决定了细胞内的蛋白组成进而决定了细胞所能进行的生命活动的性质。因此直接检测癌症相关mRNA的突变更为直观且更有意义。而DNA甲基化是最广泛的表观遗传学机制,它提供了一个稳定的基因沉默机制,在调节基因表达和染色质结构中发挥着重要的作用。因此建立快速、简便、高灵敏度、高特异性的mRNA突变及DNA甲基化的分析方法能够加深对基因表达调控的了解,并且对以甲基化DNA和mRNA为生物标志物的人类疾病特别是癌症的发生机制、早期诊断和治疗都具有重要意义。传统的检测特定位点甲基化DNA和突变mRNA的方法都需要对样品进行预处理,造成操作步骤繁琐复杂,结果易受到假阳性信号的影响。恒温指数扩增(Isothermal Exponential Amplification Reaction,EXPAR)无需要像 PCR、LCR 等反应所依赖的热循环过程;无需复杂的引物和探针,只需要一条简单的DNA模板链,设计简单;反应速度快,效率高,短时间内可以获得高达106-109倍的扩增。本论文中我们利用EXPAR建立了快速、简单、高灵敏度和高特异性的位点特异性甲基化DNA和突变mRNA的检测方法。主要研究内容如下:(1)我们首次通过甲基化依赖性限制性内切酶GlaI与EXPAR相结合,发展了一种可以高特异性和高灵敏度的检测特定位点甲基化DNA的方法。GlaI能以极佳的选择性切割甲基化的靶位点,但保持未甲基化的DNA完整。然后因酶切而新暴露的甲基化DNA末端片段可以触发EXPAR进行高效信号放大,而完整的未甲基化DNA完全不会启动EXPAR。因此,GlaI-EXPAR系统的实时荧光信号能可靠地定量反映出甲基化DNA的含量,并可有效消除未甲基化DNA潜在的假阳性干扰。因此,通过结合GlaI高度特异性的识别甲基化的特点和EXPAR快速且强大的信号放大能力,GlaI-EXPAR检测方法可以以超高灵敏度和准确度直接定量甲基化DNA。甲基化DNA靶标的检出限可低至aM水平,并且GlaI-EXPAR的整个检测过程可以在2小时的短时间内完成。更重要的是实现了超高的特异性,在大量未甲基化DNA的存在下,可以准确检测出低至0.01%的甲基化DNA。该GlaI-EXPAR体系也成功用于基因组DNA样品中位点特异性甲基化DNA的灵敏检测。由于该GlaI-EXPAR技术具备超高的灵敏度,卓越的特异性和简便的操作等独特优势,为检测低丰度的位点特异性甲基化DNA提供了一种灵敏可靠的检测平台。(2)RNase H可以剪切RNA-DNA杂交双链中的RNA,利用这一特点,我们针对突变mRNA设计了合适长度的修饰有锁核酸(LNA)的互补DNA探针,针对野生mRNA设计合适长度的互补RNA阻断链,结合单碱基错配的热力学差异和竞争性杂交核酸探针,使得RNase H能切割突变mRNA,且最大限度地保持野生mRNA的完整。酶切暴露出的突变mRNA片段可以引发高效率的EXPAR扩增,并在阻断链的作用下有效地抑制了由野生mRNA产生的假阳性信号。基于竞争性杂交核酸探针结合RNase H的EXPAR体系可以高灵敏度地检测低至aM级的突变mRNA,且整个检测过程在2个小时内即可完成。更重要的是,在RNA阻断链的作用下,可以在大量野生mRNA存在的环境中分辨出低至0.01%的突变mRNA。为检测癌症相关的点突变mRNA提供了新的思路。