论文部分内容阅读
戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway,PPP）是植物体内除糖酵解以外葡萄糖的另一主要代谢途径,是细胞内还原力NADPH的重要来源。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphat-dehydrogenase,G6PDH）作为PPP的限速酶之一,催化葡萄糖-6-磷酸氧化为6-磷酸葡萄糖酸-δ-内酯,并生成NADPH。G6PDH由核基因编码,定位于胞质和质体。大量的研究证实G6PDH在植物生长发育与逆境适应中起关键的调节作用,但其中的生理与分子机制有待进一步研究。为了从遗传学角度深入阐释G6PDH在植物生长发育和环境适应中的功能与调节机制,我们克隆了拟南芥G6PDH家族基因,构建并获得了相关超表达载体与超表达植株,同时筛选了纯合的G6PDH家族基因T-DNA插入突变体;在此基础上以胞质G6PDH插入突变体（g6pdh5,g6pdh6）为材料,初步探究了胞质G6PDH在拟南芥盐耐受性中的功能。主要研究结果如下:1.利用高保真酶成功克隆了拟南芥G6PDH家族基因（G6PDH1,1732bp;G6PDH3,1801bp;G6PDH4,1879bp;G6PDH5,1552bp;G6PDH6,1549bp）,产物大小与基因大小相同,并将其连接到p-Blunt载体上,进一步确定其序列的正确性。2.利用Gateway技术成功构建了G6PDH家族6个基因的p GWB2双元表达载体,并转化了农杆菌。3.利用花序侵染法获得了G6PDH家族各基因的超表达植株,经Hyg抗性筛选与DNA鉴定共筛选到了超表达植株G6PDH1 20株;G6PDH3 8株;G6PDH436株;G6PDH5 24株;G6PDH6 21株。4.从ABRC网站购买到了G6PDH家族基因的T-DNA插入突变体。利用三引物PCR法分别获得G6PDH2（GK319B08,插入第6个外显子）、G6PDH3（SALK＿002754,插入第9个外显子）、G6PDH4（SALK＿131208C,插入第2个外显子）、G6PDH5（CS804669,插入第10个外显子）、G6PDH6（SALK＿016157C,插入第13个外显子）5个基因的T-DNA插入突变体;RT-PCR进一步验证了上述突变体所突变基因完全被敲除。5.拟南芥G6PDH家族基因表达模式分析结果显示:在不同器官中,胞质G6PDH5和G6PDH6表达量较高;质体G6PDH1、G6PDH2、G6PDH3和G6PDH4表达量相对较低,暗示胞质G6PDH基因可能在植物生长发育与环境适应中具有重要功能。6.拟南芥WT、g6pdh5与g6pdh6种子萌发实验结果显示:G6PDH5/6基因的缺失不会影响种子萌发率,但会延迟种子萌发,且g6pdh5种子萌发的延迟程度比g6pdh6种子更为显著。7.200 m M Na C l能诱导拟南芥叶片G6PDH5和G6PDH6基因的表达,且分别在盐处理24 h和12 h达到最高峰。G6PDH活性测定结果显示盐胁迫能刺激G6PDH活性的增加（12 h时达到最大）,暗示G6PDH可能参与了拟南芥对盐胁迫的适应。8.H2O2含量与膜透性测定结果显示:与WT相比,盐胁迫下g6pdh5与g6pdh6叶片中H2O2含量累积增高;同时离子泄露水平也显著增加,说明盐胁迫下,G6PDH5和G6PDH6基因突变时,拟南芥遭受了更强的氧化胁迫,暗示胞质G6PDH可能在拟南芥抵抗盐胁迫中的具有重要作用。综合上述结果,我们成功构建并获得了拟南芥G6PDH家族基因的超表达植株,筛选了其T-DNA插入纯合体,并初步探究了胞质G6PDH在拟南芥盐耐受性中的功能,该研究为深入阐释G6PDH在植物生长发育与盐耐受性中的功能与分子机制奠定了基础。